关于干细胞移植延缓椎间盘退变及磁共振示踪研究

　　1.2.4 髓核基质含量测定

　　将实验组、模型组、对照组随机分为2、4、6、8周组4个亚组,每组2只兔; 在相应时间于兔耳缘静脉注射空气10ml处死,立即取出兔腰椎并辨认原椎间盘定位标记,确认3组相应椎间盘。

　　1.2.4.1 蛋白多糖含量测定 采用间苯三酚分光光度法[2]测定光密度值,转换为量值作蛋白多糖含量的测定。

　　1.2.4.2 病理学检测方法 取出的相应椎间盘置10%中性福尔马林保存，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、免疫组化(SABC法)检测，一抗为抗兔Ⅱ型胶原的单克隆抗体(1∶100)，DAB显色。免疫组化结果判断：阳性细胞间质呈棕黄色，应用CLeicaQ550 IW计算机图像分析系统及其软件定量评价呈阳性免疫染色的髓核细胞间质的灰度值(灰度分级0～255级,0级为最深,255级为最浅),每只兔取4张切片,每组共8张,每张切片随机采集4个高倍视野(×200)进行测定(向同一个方向移动切片,不重叠,不重复) 。测得结果为视野内棕黄色的平均灰度值。

　　1.2.5 髓核MR扫描

　　另取纯种成年新西兰大白兔3只,雌雄不限,平均体重2.5kg,按上述手术操作暴露椎间盘，不抽吸髓核直接注射SPIO标记的BMMSCs。分别于移植细胞后0、2、4周处死，取相应节段髓核作MR扫描。

　　1.3 统计学处理

　　所得数据以x-±s表示，并输入SPSS11.5统计学软件进行统计学处理。相同时间点的3组间先进行单因素方差分析，再进行两两q检验。

　　2 结 果

　　2.1 BMMSCs生长及形态观察

　　原代细胞接种后24h细胞开始贴壁，多呈圆形或类圆形，随培养天数的增加，细胞逐渐伸张为多角形或梭形，渐有集落形成;7d后细胞集落逐渐增多扩大，并彼此融合，细胞呈现梭形外观;10～12d细胞融合达90%以上，漩涡状排列，界限不清，可以传代。经0.25%的胰蛋白酶消化后的细胞呈圆形，分瓶接种后12h内开始贴壁。传代后的细胞增殖加速，培养6～9d即可再次传代(图1)。

　　2.2 SPIO标记的干细胞

　　传至第3代的细胞与磁粒子共同孵育24h，PBS反复漂洗后高倍镜下即可观察到细胞内分布有大量的黄黑色铁颗粒。细胞爬片普鲁士蓝染色(图2，见封二)，几乎每个标记细胞的胞质内均可见到蓝色颗粒，标记率近100%，与文献报道相同。

　　2.3 MR扫描

　　移植SPIO标记的BMMSCs的正常髓核不同时间MRI T2像对比，即时扫描发现注入的磁粒子形成一个低信号的浓聚区，周围为高信号的正常髓核组织，而4周后的髓核T2像即表现为均一的低信号，提示SPIO标记的干细胞植入髓核内后由移植中心区向周边髓核发生迁徙(图3)。

　　2.4 蛋白多糖含量测定结果

　　术后2、4、6、8周,实验组及对照组与模型组间蛋白多糖测定值经方差分析,差异有统计学意义(均P<0.01)。各组间再行两两q检验。各个时间点实验组与模型组及对照组与模型组之间,差异有统计学意义(均P<0.01),各时间点实验组与对照组间,差异无统计学意义(均P>0.05)(表1)。表1 不同时期各组髓核组织蛋白多糖含量 表2 不同时期各组髓核组织Ⅱ型胶原定量分析

　　2.5 病理学检测结果

　　实验组和对照组髓核组织Ⅱ型胶原染色呈强阳性,2周即显示阳性染色。模型组呈阴性或弱阳性反应(图4，见封二)。术后2、4、6、8周,3组间测定值经方差分析,实验组与模型组及对照组间，P<0.01,组间差异有统计学意义。各组间再行两两q检验。各个时间点实验组与模型组及对照组与模型组之间,差异有统计学意义(均P<0.01),各时间点实验组与对照组间,差异无统计学意义(均P>0.05)(表2)。

　　3 讨 论

　　IDD是引起下腰痛的常见病因之一，基因、环境和年龄因素都可导致IDD的发生。目前认为IDD的标志是蛋白多糖、水分、Ⅱ型胶原的丧失以及髓核中类软骨细胞向纤维细胞的转变[3-4]。随着对IDD机制认识的不断深入，细胞移植修复退变椎间盘成为一种可能的生物学治疗方法。基于对椎间盘组织退变机理的认识,目前的研究把焦点集中在椎间盘细胞,尤其是终板软骨细胞和髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)上,因为只要激活椎间盘细胞,改善细胞外基质,就可能在一定程度上缓解甚

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