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体外培养星形胶质细胞缺氧再给氧后热休克蛋白70的表达 |
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ynthesis of HSP70 protein could only be observed after reoxygenation. It is possible that HSP70 might play a protective role in hypoxia/reoxygenation of astrocytes.
【Key words】 Astrocytes; Cell hypoxia; Heat-shock proteins 70; Gene expression; Mice
围生期缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage, HIBD）的研究焦点集中在神经元上，但是星形胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system, CNS）中数量最多的细胞类型，它们在HIBD中的改变是CNS中最早和最显著的。有文献报道，星形胶质细胞在缺氧及再给氧后蛋白合成增加，并有报道其在热休克及酸中毒后有热休克蛋白70（HSP70）的强烈表达［1］。分析缺氧后星形胶质细胞内诱导的应激蛋白有助于了解星形胶质细胞在缺氧缺血时存活的机制。本研究旨在探讨缺氧再给氧后星形胶质细胞内HSP70表达的变化。
材料和方法
一、材料
动物：昆明小鼠由北京医科大学实验动物部提供。试剂：鼠源抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗体，HSP70抗体：抗诱导型HSP70（HSP72）及基础型HSP70 (HSP73)，免疫组化试剂盒（中山生物制品公司）；诱导型HSP70寡核苷酸探针：5′-CGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCACCA-TGG-3′ （美国Cybersyng公司）；地高辛DNA标记和检测试剂盒（Boehringer mannhein公司）。
二、方法
1.新生昆明小鼠大脑皮层星形胶质细胞纯培养及鉴定：基本按照梁卫兰等［2］及 Chao等［3］ 的方法进行。每次取6只生后1～2 d的新生鼠行星形胶质细胞培养，共培养12次。星形胶质细胞鉴定采用间接免疫荧光法，一抗为GFAP抗体。荧光显微镜下观察，以490 nm波长的激发光观察异硫酸酯荧光素（fluorescin isothiocyanate, FITC）所标示部位，阳性者即为星形胶质细胞。免疫荧光显示星形胶质细胞阳性率为99%左右（图1）。
2.缺氧模型的建立及实验分组：将细胞培养皿置于含体积分数为5%CO2和体积分数为95%N2的有机玻璃通气槽内，并维持一定湿度，密封。此槽置于37℃温箱内［4］（培养液成分无变化）。通气稳定后及取出细胞前均测定槽内氧浓度，使其保持稳定。缺氧组于缺氧一定时间后立即取出进行实验，再给氧组于缺氧后立即更换培养液，然后置CO2培养箱（体积分数为5%～8%，湿度为100%）内继续培养。实验分组：对照组（即缺氧0 h组）、缺氧组（根据缺氧时间不同分为3、6、12、24、48 h组）、缺氧后再给氧组（缺氧24 h后根据再给氧时间不同分为0、3、6、12、24、48 h组）。观察指标为HSP70 mRNA的表达和应激蛋白HSP70的表达。
3.原位杂交:每次取出2.75 μg诱导型HSP70 寡核苷酸探针，按试剂盒要求进行探针标记。杂交前各细胞爬片经梯度乙醇处理，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤后，依次加入0.5% Triton X-100及蛋白酶K处理，PBS洗涤。用0.25%乙酸酐和0.1 mol/L的三乙醇胺平衡电荷后，再用含乙酸胺的梯度乙醇脱水。晾干后每片滴加杂交液10～15 μl，于湿盒内，42℃反应24 h。用系列标准柠檬酸盐-氯化钠（SSC）洗涤阻断反应后，加入抗地高辛抗体，37℃保温1 h，用检测缓冲液洗涤并平衡，在碱性磷酸酶显色体系中，室温显色，光镜下观察，以深蓝色沉淀为杂交阳性信号。
4.免疫组化:细胞爬片经1%牛血清白蛋白封闭，1% Triton X-100处理后，加入1∶50 的鼠源抗HSP70单克隆抗体，4℃过夜。PBS洗3遍，加入1∶100的生物素标记的马抗鼠二抗，常温1 h，PBS洗涤，加入1∶200的卵白链霉素辣根过氧化物酶（HRP）,常温下1 h，0.02% 的二氨基苯联胺（DAB） (0.03% H2O2,0.05 mol/L Tris HCl, pH 7.4)显色5～10 min，以胞核黄染为阳性细胞。
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