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多药耐药基因反义寡脱氧核苷酸对卵巢癌细胞株SKOV3多药耐药性逆转的作用 |
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nts of drug -resistant colony in mdr1-ASON treated SKOV3/mdr1 cells and in SKOV3/mdr1 cells was 34% and 79%, respectively, (P<0.01). Conclusion mdr1-ASON can reverse multidrug resistance of ovarian carcinoma cell in a certain extent so as to increase chemotherapeutic sensitivity of ovarian carcinoma cells.
【Key words】 Oligonucleotides, antisense； Ovarian neoplasms； P-Glycoprotein； Genes, MDR
化学治疗(化疗)是卵巢癌治疗的重要手段。然而，多药耐药是导致卵巢癌化疗失败的主要原因。其中多药耐药基因(multidrug resistance gene,mdr1)产物P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的过度表达起重要作用。采用反义核酸对相应靶基因表达进行特异性抑制，是目前肿瘤基因治疗研究的重要课题。本研究以人mdr1基因转染产生的耐药卵巢癌细胞株SKOV3/mdr1为模型，观察mdr1-反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides， ASON)对其多药耐药性的逆转作用，为克服卵巢癌化疗耐药，提供实验依据。
材料与方法
一、 耐药卵巢癌细胞株SKOV3/mdr1的建立及培养条件
人卵巢癌细胞株SKOV3及人mdr1基因过度表达的逆转录病毒包装细胞Gp-envAM12/mdr1，均由军事医学科学院三所二室提供。上述细胞置以含10％胎牛血清(FBS）的达尔伯必需基本培养基(DMEM)培养液，在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。将包装细胞培养到满瓶的80％，更换培养液，置32℃培养24 h，收集病毒上清液，用0.45 μm滤器过滤后，加入到弃去培养液的75％满瓶的SKOV3细胞中，并加入8 μg/ml鱼精蛋白, 培养24 h后重复转染1次。最后弃上清液，加入原培养液，以60 ng/ml秋水仙素筛选2周，从而获得耐药卵巢癌细胞株SKOV3/mdr1。分别提取SKOV3及SKOV3/mdr1细胞的DNA, 经mdr1cDNA聚合酶链反应(PCR)扩增鉴定，SKOV3/mdr1细胞中有外源性mdr1基因的整合，而SKOV3细胞中无外源性mdr1基因的整合。
二、方法
1.寡脱氧核苷酸的合成： 设计针对mdr1mRNA翻译起始部位的ASON和对应的正义寡脱氧核苷酸(SON)，由上海Sangon生物工程公司合成，均经过全硫代磷酸化修饰。mdr1-ASON和mdr 1-SON的碱基序列分别为5′-GTCCCCTTCAAGATCCAT-3′和5′-ATGGAT CTTGAAGGGGAC-3′［1］。
2.寡脱氧核苷酸作用于SKOV3/mdr1细胞： 将SKOV3/mdr1细胞按1.5×105密度接种于6孔培养板，每孔加2 ml含10％FBS的DMEM培养液。在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，分别于第24、48、72、96小时，将ASON及SON液依次分别按100、50、50、50 μg/ml的浓度，加入相应的mdr1-ASON及mdr1-SON细胞，总剂量为250 μg/ml。再培养24 h后，胰酶消化收集细胞进行检测及集落培养。取SKOV3及SKOV3/mdr1细胞同条件培养，但不加寡脱氧核苷酸，作为对照。
3.检测细胞表面P-gp阳性率： 按法国Immunotech公司产品说明书进行。用藻红蛋白(PE)标记的P-gp单克隆抗体UIC-2(Immunotech公司产品)标记各细胞，然后用流式细胞术(FCM)测试细胞P-gp的阳性率。
4.检测细胞P-gp功能：收集各细胞1×106, 重悬于含150 ng/ml罗丹明的DMEM培养液中，在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养15 min，用磷酸缓冲盐液洗涤细胞2次，加入1 ml含10%FBS的DMEM培养液中继续培养1 h后，以FCM测定细胞内罗丹明的潴留，即罗丹明123排出试验［2］。
5.耐药细胞集落培养：采用软琼脂内集落培养，将细胞按每孔2.5×1上一页 [1] [2] [3] 下一页
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