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荧光原位杂交技术在胚胎植入前性别诊断中的应用 |
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s; In situ hybridization, fluorescence; Sex determination(analysis)
目前全世界已发现了300多种性连锁隐性遗传性疾病，其中只有少数能进行基因测序或利用多态现象进行分析。大多数性连锁隐性遗传性疾病只能在产前检查时选择女性胎儿来避免有基因表现型的男性患儿的出生。植入前性别诊断可选择女性胚胎移植入子宫，从而避免选择性流产和重型患儿的出生［1］。应用于植入前性别诊断的方法有单细胞聚合酶链反应（PCR）和荧光原位杂交(FISH)技术。FISH相比于单细胞PCR，其优越性体现在污染的可能性小、检测的时间短以及能同时检测染色体的倍数，从而避免将非整倍体胚胎移植入宫腔［2］。本中心从1999年1月始应用FISH技术，对部分遗传病进行植入前性别诊断，现报道如下。
资料与方法
一、研究对象
1999年1月至1999年9月期间，本中心应用FISH技术进行了4例患者5个治疗周期的植入前性别诊断。2例为甲型血友病基因携带者［其中顺产分娩甲型血友病患儿1例（例1），引产分娩可疑甲型血友病患儿1例（例2）］，其中1例进行了2个周期的治疗。同时我们还进行了2例Y染色体异常患者［例3（46，XY），例4（Y=18）］植入前性别诊断。
二、研究方法
1. 超排卵方案：例1第1个周期和例 3、4采用本院常规短方案超排卵治疗［3］。例1第2个周期和例2因月经周期不规则，采用长方案［4］。当主导卵泡直径达18 mm或3个以上主导卵泡平均直径达16 mm时，注射10 000 IU的人绒毛膜促性腺激素。36 h后经阴道B超介导下取卵。
2．体外授精和胚胎培养： 例1和例2用常规体外授精（in vitro fertilization, IVF）方法授精，在取卵后4～6 h每个卵加入10～15万个精子。例3和例4分别因无精症和少弱精症，用单精子卵泡浆内注射方法授精。16～18 h后观察受精情况。除例1第1个周期用 Earles平衡盐溶液培养外，其余周期的胚胎均用IVF 50 培养。分别在取卵后第2天下午5点和第3天上午8点观察胚胎的发育情况。根据胚胎细胞数、卵裂和碎片情况给胚胎评分。
3. 活检：活检方法参照Handyside等［1］的方法。
4．细胞的固定：用内径70 μm的细针吸出活检的卵裂球，然后将其放入1μl 含0.1%Tween 20，0.01 mol/L盐酸的溶液中固定，在解剖镜下观察直至细胞浆完全去除。
5．FISH： 探针选用美国Vysis公司的染色体计数探针(CEP)，其中X染色体探针用橙色标记，Y染色体探针用绿色标记。18号染色体探针用绿蓝色标记。除例1第1个治疗周期用CEP X和CEP Y探针外，余周期均用CEP X、CEP Y和CEP 18探针。FISH步骤详见参考文献［5］。杂交完成后加入10 μl 1.25μg/L的4′，6-diamidino-2-plenylindole复染剂复染10 min，奥林巴斯BX 60荧光镜下分别用罗丹明、异硫氰酸荧光素和绿蓝荧光素滤片观察结果。每个植入前诊断周期均选用正常男性的淋巴细胞作对照。
6.结果评定：当细胞同时出现红、绿信号各1个和两个绿蓝色信号时，诊断为正常男性胚胎细胞（XY）。仅当同时出现两个红色和两个绿蓝色信号时，诊断为正常女性胚胎细胞（XX）。只要胚胎细胞中有绿色信号出现即诊断为男性胚胎。
7．胚胎移植和胚胎冷冻：根据FISH结果，选择评分高、可继续分裂的女性
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