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体外无血清小鼠胚胎种植模型的建立 |
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中心提供的4周龄昆明小鼠150只，每只腹腔内注射hMG 7.5 IU，48 h后腹腔内注射hCG 10 U，于当日下午4时与同种雄鼠按1∶1比例合笼过夜，次日晨检查发现有阴道交配栓者即判定为妊娠第1天（D1）。hCG注射后4 d，脱颈椎法处死小鼠，取出双角子宫，用30 G针头连接1 ml注射器（含培养液）冲洗双侧子宫角，于解剖显微镜下以巴氏管采集形态正常的桑椹胚（morula）和囊胚（blastcyst）用于培养。
2．人类蜕膜细胞的获取和培养：对早孕人工流产健康妇女，于术中用无菌瓶收集蜕膜标本，置于盛有100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的-4℃的无钙平衡盐液（D-hanks）中，即刻送至实验室进行消化和培养。本实验对冷颖等［1］及 Yoshimura等［2］报道的方法进行了简化和修改。复合消化酶由0.25％胰蛋白酶、0.2％ 透明质酸酶和0.2％ 胶原酶，按2∶1∶2的比例（V/V）混合而成，消化时间30～40 min，消化期间无须震荡。消化后细胞直接进行培养，过夜换液清除污染的红细胞和未贴壁成分。
3．体外无血清胚胎种植模型的建立：取传代蜕膜细胞以1×105个/ml接种到12孔培养板上，一般24 h左右蜕膜细胞即可铺满培养孔的70%～80%，此时换无血清培养基，4～6 h后即可加入孕4 d小鼠胚胎进行共同培养，每孔加入胚胎10～20个。在37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养4 d。自培养开始，每12 h在显微镜下观察胚胎的发育、孵化、粘附、种植及外延生长的过程,并记录摄影。
结果
传代蜕膜细胞与小鼠胚胎共同培养4 d后，蜕膜细胞形态保持完好，无脱落。
胚胎经培养12 h，大部分形态正常的胚胎已发育至囊胚期，并孵化出透明带。部分发育较迟胚胎的透明带正在脱落，孕卵透明带出现缺口，滋养细胞及部分囊腔呈疝气状由透明带缺口突出，已脱落的透明带呈空壳状。孵化胚胎较孵化前略有增大，外周滋养细胞呈单层排列，清晰可数；内细胞团（inner cell）增大，清晰可辨。此时稍稍倾斜平皿，镜下可见囊胚沿平皿底部蜕膜细胞表面滚动，说明胚胎尚未粘附；培养24 h，囊胚较前明显增大，以其背向内细胞团的一极与蜕膜细胞接触，此时倾斜平皿或用极细孔径的巴氏管轻轻吹向囊胚，不能使囊胚移动位置，但可使囊胚以粘附一极为支点轻轻左右摇动，说明囊胚此时已发生粘附，即囊胚滋养细胞与蜕膜细胞和细胞外基质之间，已建立了细胞表面的连接。培养36 h发现，囊胚与蜕膜细胞的接触面积明显增大，大量的滋养细胞在此处增生成复层，囊胚腔仍清晰可见，见图1。
培养48 h后，胚胎与蜕膜细胞的接触面进一步增大，胚胎整体呈匍匐状与蜕膜细胞全面接触，其体积进一步增大。此时因卵柱形成，囊胚腔已难以看清，见图2。 培养72 h后，胚胎滋养细胞从外胎盘锥(extraplacental cone,EC)部分外延生长，多个滋养细胞结节突起使此时的胚胎失去其原有的球形而变为不规则。因滋养细胞长入蜕膜细胞与平皿间隙，而使胚胎周围蜕膜细胞略微高起，呈被推挤状，此为滋养细胞浸入的结果。部分胚胎停止发育，外观色泽变暗。培养96 h后，一些生命力较旺盛的胚胎继续发育成为明显的3个部分：(1)底部：相当于与蜕膜细胞密切接触的外胎盘锥部分;(2)中间部分:呈索状漂浮于培养液中，相当于鼠胚的胚外外胚层;(3)索状物的顶端成囊状结构，相当于外胚层，囊状结构为羊膜囊腔。至此，无血清小鼠胚体外种植模型建立成功。以上胚胎体外发育过程与文献报道基本相同［3］。
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