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急性髓性白血病细胞CD87表达及其意义 |
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D87 might be used as one of the markers for leukemia diagnosis, typing and prognosis, and also for myeloid leukemia cells differentiation.
【Key words】 Receptors, cell surface Leukemia, myelocytic, acute Flow wtometry
许多恶性肿瘤细胞尿激酶受体(urokinase receptor, uPAR ,CD87)表达增高，并参与其浸润、转移等过程。进一步研究表明，CD87还参与肿瘤细胞的增殖、分化、信号传导等［1］。既往肿瘤CD87的研究多局限于实体瘤，但近几年来的研究表明，在部分白血病细胞也有CD87的表达［2］。其意义有待于进一步研究。我们用流式细胞术检测了54例小儿急性髓性白血病细胞(acute myeloid leukemia, AML)CD87的表达，并报道了CD87表达与临床表现及预后的关系。另外，还检测了不同的白血病细胞株在诱导分化过程中CD87表达的改变。
对象及方法
一、对象
54例AML及20例急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)均为本院确诊的初治患儿。男42例，女32例；年龄5个月～14岁，其中M1 6例，M2 27例，M3 10例，M4 4例，M5 6例，M6 1例；L1 15例，L2 4例，L3 1例。
二、主要试剂和材料
CD87单抗为America Diagnostic公司产品。淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。异硫氰酸荧光素标记羊抗鼠单抗(FITC-GAM IgG)为邦定公司产品。RPMI-1640及逆转录酶MMLV为Gibcol公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。氟波酯(phorbol myristrate acetate, PMA)为Sigma公司产品。以无水乙醇配制成浓度为16 μmol/L的贮存液，置-20℃保存。三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)及DNA分子量标准购自Sangon公司，Taq酶为Boehringer Mannheim公司产品。随机6寡聚核苷酸引物及RNA酶抑制剂(RNAsin)购自华美生物工程公司。
三、流式细胞术检测方法
取骨髓血经淋巴细胞分离液，常规分离制备单个核细胞悬液，0.01 mol/L PBS洗涤，锥虫蓝活细胞计数>95%。10%胎牛血清孵育30分钟以封闭Fc受体。以PBS调整细胞密度为2×105/ml，取细胞悬液100 μl加CD87单抗20 μl（l∶50稀释），室温孵育30分钟，阴性对照加鼠IgG代替一抗，经PBS洗涤后，加FITC-GAM IgG 20 μl(1:10稀释)，室温下避光30分钟，经PBS洗涤后流式细胞仪（Coulter公司，Epics XL型）检测。每例检测5 000～10 000个细胞，阳性判断标准为荧光阳性细胞>20%。
四、白血病细胞株的诱导分化
白血病细胞株HL-60、U937、K562细胞悬浮于RPMI-1640培养液（含15%胎牛血清），分别加入PMA终浓度为50 nmol/L，细胞起始密度为2×105/ml，置37℃，5%CO2培养箱，培养5天，分别于作用前及作用后1、3、5天，取部分细胞用流式细胞术检测其CD87表达的改变。
五、细胞形态观察及硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验
U937、K562、HL-60细胞经PMA作用前及作用后1、3、5天后取部分培养细胞涂片，瑞氏染色，光镜下观察形态。部分培养细胞悬液加入等量0.2% NBT Hank′s液（无Ca2+, Mg2+）混匀后，37℃孵育30分钟离心制片，瑞氏染色，计数200个细胞中阳性细胞数。
六、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
根据CD87 cDNA序列设计合成引物（由法国Genset公司合成），引物序列为：
引物Ⅰ：5′-CTG CTGCTGCTCCACACCTG-3′
引物Ⅱ：5′-ACGCCCTTCTTCACCTTCCTG-3′
扩增产物为450 bp，β-actin作为内参照（由中国科学院上海细胞所合成），引物序列为：
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