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儿童急性淋巴细胞白血病微量残留病细胞的DNA定量研究 |
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lapse of ALL. ② MRD-DNA was elevated (>0.05%) 7 months prior to the relapse. ③ The patients with continuous complete remission (CCR) over 3 years and with negative MRD or MRD≤0.05% persistently could be considered to terminate the chemotherapy. Conclusion The CPCR method was a simple, sensitive and accurate MRD-DNA quantitative method. It may play an important role in evaluating the chemotherapy efficiency, predicting relapse and prognosis and guiding clinical
【Key words】 Leukemia, lymphocytic, acute Neoplasm, residual DNA Polymeras chain reacction Sequence analysis
急性淋巴细胞白血病（ALL）微量残留病（MRD）的定量监测是治疗ALL的重要环节。本研究旨在建立一种简捷、实用的竞争性聚合酶链反应（competitive polymerase chain reaction, CPCR）-DNA定量方法，对ALL患儿MRD-DNA进行动态定量研究，以探讨MRD量的变化与临床疗效、复发、预后及终止化疗时间的相互关系。现将结果报告如下。
材料及方法
一、标本
经我院儿科诊治的70例ALL患儿，男48例，女22例；初诊年龄2～13岁，中位年龄7岁。70例ALL共收集162份新鲜骨髓液及骨髓涂片标本，参考Sambrook等［1］和Fey等［2］提供的方法提取骨髓DNA，测定其纯度及质量浓度（μg/ml）。
二、形态学和免疫学分型
按1980年和1986年全国白血病分类分型标准分型。采用间接免疫荧光技术，进行单克隆抗体（McAb）免疫分型，骨髓阳性细胞>30%为阳性标准。B-ALL按六型分类法分型［3］，T-ALL按三型分类法分型［4］。
三、定性PCR反应
扩增TCR Vδ2Dδ3基因重排特异性引物序列［5］：
5′-TGG CCC TGG TTT CAA AGA CAA TTT CCA-3′
5′-TGC TTG CTG TGT TTG TCT CCT GAG GCA -3′
经PCR条件优化和扩增，特异性片断约250 bp。
四、CPCR方法
1.获取内参照竞争模板：根据在引物5′端外接序列不影响PCR扩增特异性的原理［1］，设计合成5′修饰引物，扩增PBR322质粒DNA，产物经低溶点agarose电泳及wizard PCR preps DNA purification kit(promage产品)纯化回收，获得内参照竞争模板，分装后在-20℃条件下保存备用。
2.标准曲线制作：取5 μg初发ALL患儿的骨髓DNA，以正常骨髓细胞DNA连续对数稀释后，分别与恒定量的内参照竞争模板扩增，产物电泳后，特异性条带分别为250 bp、476 bp，用GDS-UVP8000凝胶成像仪及分析软件进行吸光度定量分析。取已知对数稀释后DNA加入量的对数值与二种扩增产物吸光度比值的对数值作坐标图。用坐标图中指数增长稀释点的对数值（Y）及吸光度比值的对数值（X）进行直线回归分析，得到校准曲线（Y＝-0.482+5.623X，r=0.98, P<0.001），用于MRD-DNA定量分析，其数值相当于骨髓中MRD细胞DNA占有核细胞DNA的比例。
五、PCR产物直接测序
为确定PCR产物中ALL细胞克隆的存在和了解TCR Vδ2Dδ3连接区序列变化及其意义，采用5′-Vδ2和3′-Dδ3引物进行PCR扩增［5］，随机抽样5例阳性PCR产物,进行纯化回收及测序。
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