槲皮素对人卵巢癌HO 8910细胞增殖与凋亡的影响

　　人卵巢癌细胞株HO-8910(中科院上海细胞所提供);槲皮素(Sigma公司)，25 ℃溶于DMSO中;Bcl-2抗体(FITC)及p53抗体(FITC)及同型对照为pharminga公司;胰蛋白酶、RPMI-1640 (华美生物公司);MTT及二甲亚砜DMSO(sigma公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　人卵巢癌HO-8910细胞株，培养基为RPMI-1640内含10%灭活胎牛血清、37 ℃、5%二氧化碳的饱和湿度培养传代。

　　1.2.2 实验分组

　　共分5组：实验组：加入槲皮素，终浓度分别为10.0 μmol/L，20.0 μmol/L,40.0 μmol/L及80.0 μmol/L组;对照组：加入等量的同型IgG1单克隆抗体。(每组设6个复孔)

　　1.3 实验指标的检测

　　1.3.1 MTT试验

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×105个/mL的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔200 μL，过夜贴壁后;实验组加入10.0 μmol/L，20.0 μmol/L,40.0 μmol/L及80.0 μmol/L的槲皮素，对照组加等量的同型IgG1单克隆抗体。每组设6 个复孔，继续培养24、48 h后加入MTT(5 mg/mL) 20 μL/孔，4 h后吸净上清液，加入DMSO 20 μL/孔，震荡10 min，用酶标记光仪在波长为560 nm时测定每孔的吸光度(A)值，计算不同浓度抗体对细胞增殖的抑制率[抑制率=(对照组A均值-实验组的A均值) /对照组A均值] [2]。

　　1.3.2 流式细胞仪检测细胞周期

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液，接种于6孔培养板中，按上述浓度培养48 h后，收集细胞，PBS洗涤，制成单细胞悬液，用70%的冰乙醇4 ℃固定12 h，用含核糖核酸酶及碘化丙锭的染液染30 min，上流式细胞仪进行检测。

　　1.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液，接种于6孔培养板中，按上述浓度培养48 h后，收集细胞，用AnnexinV-FITC/PI双标记染色后做流式细胞仪双色分析。

　　1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和p53蛋白表达

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液，接种于6孔培养板中，按上述浓度培养48 h后，收集细胞，70%的冰乙醇4 ℃固定过夜，洗去乙醇，取1×106个细胞加10 mL FITC标记的抗Bcl-2和p53抗体及同型IgG1单克隆抗体，在4 ℃暗处孵育30 min洗去多余单抗。上流式细胞仪获取信息(本实验重复4次)。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量数据均用x±s表示，统计方法采用各组数据两两比较采用方差分析，组间比较采用q检验。P<0.05具有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 MTT试验结果

　　实验结果显示：槲皮素对HO-8910细胞的生长具有明显的抑制作用,实验范围内最大抑制率达67.01%，且抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强，呈现剂量、时间依赖性作用,经统计学检验差异具有显著性意义(P<0.01，见表1)。表1 实验组和对照组卵巢癌细胞内的吸光度值和增殖抑制率(略) 注：*每个浓度组与前一浓度组比较P<0.01;△每个时间段与前一时间段比较 P<0.01

　　2.2 槲皮素对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响

　　不同浓度槲皮素作用卵巢癌细胞48 h后，与对照组相比，细胞周期分布、凋亡率均发生改变，即G1/G0期细胞比例数上升，S期和G2/M期下降，细胞凋亡率上升，均有显著差异(P<0.05)，且与槲皮素浓度之间具有剂量依赖性(P<0.05，见表2)。表2 槲皮素对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响(略) 注：*每个浓度组与前一浓度组比较P<0.01

　　2.3 槲皮素对凋亡相关蛋白Bcl-2、p53表达的影响

　　不同浓度槲皮素作用卵巢癌细胞48 h后，与对照组相比，促凋亡蛋白p53表达上调，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下降，均有显著差异(P<0.01)

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