白介素6拮抗N甲基D天门冬氨酸诱导的神经元凋亡

    [Key words]   Neuronal apoptosis; Interleukin-6; N-methyl-D-aspartate; Bcl-2; Bax; Caspase-3; Rat

    缺血缺氧等各种因素引起神经系统损伤时，神经末稍释放大量谷氨酸等兴奋性氨基酸，激活N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体，从而产生严重的神经毒性，引起神经元的损伤或死亡[1]。NMDA是谷氨酸受体亚型的激动剂，已有实验证实，NMDA能通过“兴奋性氨基酸毒性”诱导脑皮质细胞[2]和视网膜神经节细胞凋亡[3-5]。因此，抑制神经元凋亡可成为治疗某些神经系统疾病的关键。

    近年来，细胞因子对神经系统的生长、发育和功能的影响已受到了广泛的关注。白介素-6（interleukin-6，IL-6）是一个多功能的细胞因子，在中枢神经系统的生理病理过程中扮演重要角色。在正常脑组织中IL-6的含量较低，但在某些病变的脑内IL-6的含量将会迅速而显著的增加[6-9]，说明IL-6与这些神经系统疾病有密切的关系且可能与修复神经元有关。然而，在这些神经系统病理状态下IL-6产生的意义尚不明确，仍有许多问题需要进一步的探讨。为此，我们利用NMDA诱导培养的小脑颗粒神经元（cerebellar granule neurons，CGNs）的细胞凋亡模型，在抗凋亡Bcl-2、促凋亡Bax和凋亡关键酶caspase-3的基因水平，观察IL-6的神经保护作用。

    1   材料和方法

    1.1   CGNs的培养   取出生 8 d的Sprague-Dawley SD幼鼠2只，雌雄不拘。低温麻醉后取出小脑，用眼科剪把组织剪成1 mm3左右大小，胰酶消化后加入胰酶抑制剂和DNaseⅠ终止消化。最后细胞加入适量含有10%胎牛血清（杭州四季青公司）和25 mmol/L氯化钾的BME（Basal Eagles Medium，美国Sigma公司），以2.83×105个/cm2的细胞密度接种于用多聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine，美国sigma公司）25 μg/ml包被的培养板中，然后置于5% CO2的 37℃培养箱（日本ESPEC公司）中培养 8 d。此外，接种后24 h在培养物中加入10 μmol/L Ara-C以抑制胶质细胞的生长，使神经元的纯度达95%以上。

    1.2   IL-6慢性预处理CGNs   在CGNs培养的第1、4、7 d，加入IL-6（美国R&D公司）到培养物中，使IL-6的浓度在整个8 d的神经元培养期间始终保持在40 ng/ml。

    1.3   NMDA急性损伤CGNs模型   上述培养8 d的CGNs，吸出培养液，用Locke缓冲液洗1遍，加入含NMDA（美国Sigma公司）100 μmol/L的Locke缓冲液，20 ℃作用30 min后吸弃，用 BME洗1遍，再加入原先吸出的培养液置于CO2培养箱中，5% CO2 37 ℃孵育6 h。

    1.4   Real-time PCR法检测CGNs内Bcl-2、Bax及caspase-3 的mRNA 表达   取予不同处理的CGNs，提取RNA。逆转录生成第一链cDNA，再进行实时PCR扩增。引物由Invitrogen生物技术公司合成。序列如下：Bcl-2-sense：5’-GCAGAGATGTCCAGTCAG C-3’，Bcl-2-antisense：5’-

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