的RNA的提取 在加入不同物质作用后4、12、24 h收集细胞，采用Trizol抽提试剂盒提取总RNA，且用紫外分光光度计测RNA在260和280 nm的吸收度 （OD值），计算RNA的含量和纯度。大鼠肾小球系膜细胞的GAPDH，Smad2，COX-2的基因序列通过基因库获得，根据Primer 3软件设计引物，再经GenBank BLAST进行同源性检测，引物设计通过Primer5.0软件完成，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物的序列及扩增片段长度见表1。 1.3.2 RT-PCR 参照逆转录试剂盒（Promega公司）说明书方法先逆转录合成第1条cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应，按不同PCR反应条件在PCR扩增仪上进行实验扩增。GAPDH：94 ℃预变性5 min，92 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环30次，72℃延伸3 min；Smad2：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循环30次，72℃延伸7 min；COX-2：94 ℃预变性5 min，92 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次，72 ℃延伸5 min。4 ℃终止，产物储存于-20 ℃。
取10 μl PCR产物以1.2 %琼脂糖凝胶电泳（含终浓度为5 μg/ml的溴化乙锭）后紫外检测仪观察，用凝胶图像成像系统成像及进行扫描定量分析DNA，以目的片段/内参照GAPDH片段的条带光密度（OD）作半定量值比较。至少重复3次独立的RT-PCR全过程。
1.4 统计学方法 采用Stata 7.0软件，计量数据以■±s表示；各处理组与空白对照组之间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 NS-398抑制 TGF-β对COX-2 mRNA表达的影响 对照组有微弱的COX-2 mRNA表达，用不同浓度的TGF-β作用不同时间后COX-2 mRNA表达量明显增加，呈浓度和时间依赖性，TGF-β的此种作用能被NS-398和Staurosporine所抑制，且呈时间依赖性，见表1、图1~3。
2.2 NS-398抑制 TGF-β 对细胞内Smad2 mRNA表达的影响 对
照组有微弱的Smad2 mRNA表达，用不同浓度TGF-β刺激后Smad2mRNA表达量在4 h后开始升高，呈时间依赖性和浓度依赖性。TGF-β的此种作用能被NS-398和Staurosporine所抑制，且呈时间依赖性，见表2、图4~6。 3 讨论
TGF-β是各种肾脏病如肾小球硬化和肾间质纤维化发生、发展的必需因子， 其过度产生在许多肾脏病中引起了不可逆的间质纤维化[3]，有研究表明TGF-β可诱导多种细胞分泌合成COX-2，如成纤维细胞和平滑肌细胞等，且能活化调节COX-2启动基因的因子如AP-1和NF-KB。动物（狗和鼠）和灵长类（猕猴和人）的肾脏都有COX-2和COX-1的表达， COX 产物的多样性与其受体的多样性决定了COX产物在肾脏中表现出复杂的生物学作用，COX-2 是与炎症相关的酶，其可被内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞所分泌的炎症介质所诱导产生，动物实验证实[5]，使用特异性COX-2 抑制剂可明显减少蛋白尿，作为COX-2 的代谢产物尿TXB2 也明显减少，病理检查示大鼠肾小球硬化程度也明显减轻。
我们分别用5、10 ng/ml TGF-β刺激系膜细胞4、12、24 h，发现肾小球系膜细胞中COX-2 mRNA的表达随时间的增加而表达增加，且在相同时间段不同浓度的TGF&nd
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