糖基化终产物对人单核细胞EMMPRIN基因表达的影响

    1   材料与方法

    1.1   材料   牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，AMRESCO产品）；1640培养基（Gibco公司）；胎牛血清（浙江省杭州四季青公司）；DNA Ｍarker DL2000，天为时代公司）；EMMPRIN及GAPDH引物由上海生工合成；其他试剂均为国产分析纯。

    1.2   方法

    1.2.1   AGE-BSA的制备   BSA浓度为5.0 g·L-1，葡萄糖浓度为50 mmol·L-1，充分溶解于pH7.4 PBS后，过滤除菌，37 ℃无菌避光孵育90天。PBS溶液透析去除未结合的葡萄糖。同样条件制备不含葡萄糖BSA作为阴性对照。荧光光谱扫描分析鉴定AGEs。其激发波长370 nm、发射波长440 nm、狭缝为3 nm。

    1.2.2   细胞培养及干预实验   人单核细胞（U937）用含10%胎牛血清的1640培养液，置37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。将细胞接种于六孔板中，每孔1×104个细胞，待细胞达到次融合状时，换用无血清的培养液饥饿24小时后，分组进行干预，以1640组和BSA组（200 mg·L-1）为对照组，每组两个复孔。加入不同浓度的AGEs（50、100、200、400 mg·L-1）干预细胞， 24小时后收集细胞；以200 mg·L-1的AGEs分别干预细胞8、16、24、48小时，以1640组和BSA组（200 mg·L-1）为对照组，每组2个复孔。

    1.2.3   RT-PCR检测单核细胞的EMMPRIN mRNA的表达   采用Trizol法提取各组细胞的总RNA，经紫外分光光度计测定RNA的OD260与OD280在1.60~1.80，1%的甲醛变性凝胶电泳证实总RNA的完整性较好（28s与18s两条电泳带吸光度比值等于1.8∶1.0）。

    立即取2 μg总RNA为模板逆转录，根据文献，由上海生工公司合成EMMPRIN和GAPDH单核苷酸引物。EMMPRIN上游：5’-GGCCAGAAAACGGAGTTCAA-3’，下游：5’-GCGCTTCTCGTAGATGAAGA-3’；GAPDH上游：5’-GGAGTCAACGGATT TGGT-3’，下游：5’-GTGATGGGATTTCCATTG AT-3’。用这两对引物可扩增出长度约为492 bp的EMMPRIN CDNA片段及长度约为206 bp的GAPDH CDNA片断引物合成后用去RNA酶水溶解，工作浓度为10 mol/L。选择PCR的循环数28，保证PCR产物在线性增加范围内。

    PCR反应体系为50 μl（10×Buffer 4 μl、25 μM MgCl2  4 μl、cDNA 4 μl、2.5 mmol/L dNTP 2 μl目的序列上下游各1 μl，GAPDH序列上下游各1 μl，水31.5 μl，Taq酶0.5 μl）反应条件:94 ℃ 2 min预变性，然后94 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min进行28个循环扩增，再以72 ℃延伸8 min。

    PCR产物的检测和分析：5 μl PCR产物和1 μl 6×上样缓冲液进行2％琼脂糖凝胶（含0.5 m

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