糖尿病大血管病变方面起着潜在作用,因此日益引起关注。本研究通过测定各阶段糖尿病大鼠血浆中血栓调节蛋白变化及颈动脉的病理变化,探讨在糖尿病动脉粥样硬化发生、发展的各阶段血栓调节蛋白所起的重要作用,为防治糖尿病动脉粥样硬化发生、发展寻找一条新的途径。 1 材料与方法
1.1 材料 (1)实验动物:选用近交、清洁级Wistar 大鼠48只(山西医科大学动物中心提供),12周龄,雄性,体重220~250 g;(2)药物及试剂:链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司;血糖采用罗氏公司ACCU-CHEK优越血糖仪测定;血栓调节蛋白、空腹胰岛素、C肽、血脂用酶联免疫方法测定(Rat)试剂盒购于大连泛邦生物制剂公司,批内差异﹤10%;颈动脉内中膜厚度的测定。
1.2 实验方法
1.2.1 分组及剂量 随机分为正常对照组24只(A组),实验组24只 (B组),两组再分为6周、10周和14周组,共计6组。均自由进食进水,12 h光照周期。A组腹腔注射50 mg/kg体重的枸橼酸缓冲液以pH4.2的0.1 mmol/L作对照。B 组腹腔一次性注射STZ 50 mg/kg体重 (以pH4.2的0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液配成0.1%浓度)。72 h测空腹血糖>16.7 mmol/L为造模成功。
1.2.2 标本的采集和处理 造模成功后6、10、14周时两组各取8只大鼠称重、剪尾测空腹血糖,腹腔麻醉,分离右颈动脉,心内采血6 ml分别置于于含有枸橼酸钠抗凝剂的试管和普通试管中各3 ml,离心2500 r/m×15 min,用所分离的血浆测定血栓调节蛋白,血清测定空腹胰岛素、C肽及血脂。
1.2.3 光镜、电镜观察 取下右颈动脉,置入10%甲醛液,常规梯度乙醇脱水,石蜡包埋,制备载玻片,光镜下观察病理变化。在同上位置连续切下2~3个1 mm宽环,2%戊二醛固定2 h,二甲胂酸钠缓冲液内放置若干天后,1%锇酸固定2 h,丙酮梯度脱水,618环氧树脂包埋,超薄切片,铅铀染色,透射电镜(JEM-100EX Japan)下观察。
1.2.4 颈动脉内中膜厚度的测定 使用四川大学智胜软件股份有限公司Mias-2000真彩色病理显微图像分析系统进行分析。每例标本的病理切片上随机选取5个不同位置,对颈动脉内中膜厚度进行测定,取其均值作为每例标本内中膜的厚度。
1.3 统计学方法 所有数据采用SPSS12.0统计软件处理,结果以■±s表示,影响因素的比较采用两因素析因设计的方差分析,组间比较采用t检验和方差分析,两变量间的相关关系用Pearson直线相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1.1 由表1、2可见B组大鼠体重在6周时与A组无明显差别,10、14周时较A组有显著降低(分别为P<0.05,P<0.01)。B组空腹血糖均值达26.72 ±4.02 mmol/L较A组差异有统计学意义(P<0.01),达到糖尿病诊断标准,而A组大鼠空腹血糖变化不明显。空腹胰岛素(INS)及C肽、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)在第6、10、14周时较A组均有显著差异(P<0.01),高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)在6周时两组间差异无统计学意义。在10周时分别有降低、增高的趋势,但差异无统计学意义;在14周时HDL、LDL分别明显低于、高于A组(P<0.05)。
2.1.2 由表3可见B组大鼠血栓调节蛋白在第6、10、14周时始终保持上升趋势,与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);右颈动脉内中膜厚度在6周时较A组增加但不显著,在10、14周时较A组厚度明显增加(P<0.01)。
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