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正常早孕蜕膜非免疫细胞免疫活性的实验研究 |
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学科学院北京肿瘤研究所提供；昆明白小鼠由中国科学院动物研究所饲养场提供，共20只。
二、方法
1.蜕膜细胞培养：将蜕膜组织洗涤、剪碎，用0.1%胶原酶于37℃水浴中振荡消化后，通过静置沉淀法获取单个分离的蜕膜细胞。将蜕膜细胞置于含10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640完全培养液中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养6～7天直至细胞汇合。弃去旧的培养液及悬浮于其中的蜕膜淋巴细胞，换入新鲜的培养液。于继续培养后12、24、48小时收集蜕膜细胞培养的上清夜，冻干备用。
2.人外周血淋巴细胞（hPBL）分离：无菌采集正常献血员肘静脉血，经肝素抗凝，加在比重为1.077±0.002的淋巴细胞分离液液面之上，1 000 r/min离心20分钟，取交界面hPBL。将于培养12、24、48小时采集的蜕膜细胞培养上清液与hPBL放于96孔板内，37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48小时作为实验组，不加上清液者为空白对照组。
3.T淋巴细胞转化：在两组中加入0.04%的植物血凝素（PHA），继续培养72小时，在最后4小时于96孔板中加入0.5 μCi氚-胸苷(3H-TdR)。培养结束后收集淋巴细胞，液闪仪测定每孔的脉冲指数(cents per minute, CPM)，按公式计算抑制率：抑制率（%）=［（空白对照组CPM值-实验组CPM值）/空白对照组CPM值］× 100%。
4.自然杀伤（NK）细胞活性测定：在两组的每孔中滴加1×105个 51铬酸钠（Na251CrO4）标记后的K562细胞，使靶细胞与效应细胞之比达到1∶25。实验同时设置自发释放组(K562细胞悬液100 μl+培养液100 μl)及最大释放组［K562细胞悬液100 μl+0.05%乙酰基苯基聚乙二醇(NP-40)］。效、靶细胞于继续培养4小时后，取其上清液，γ-闪烁仪测定各孔CPM值，按公式计算杀伤率及抑制率：杀伤率（%）=［（实验组CPM值-自发释放组CPM值）/（空白对照组CPM值-自发释放组CPM值）］× 100%。
5.淋巴细胞释放白细胞介素2（IL-2）的测定：采用活化的淋巴细胞母细胞法。取小鼠脾淋巴细胞，用5 μg/ml刀豆素A（ConA）在37℃、5%二氧化碳条件下培养48小时后，配成1～10×106个/ml浓度，加入两组的96孔板里，继续培养24小时，收集小鼠脾淋巴细胞，液闪仪测定每孔的CPM值。
6.B淋巴细胞分泌IgG的测定：采用一步温育双抗加聚二乙醇法。将25 μg/ml葡萄球菌A蛋白（SPA）加入上述两组的96孔板内，培养6天后取上清液。用γ-计数仪测定各孔CPM值，并计算其抑制率。
三、统计学分析
数据采用计算机Slide统计软件进行分析。CPM的测定值以±s表示，t检验确定差异的显著性。
结果
一、蜕膜细胞上清液对T淋巴细胞转化的影响
培养12、24和48小时3个时相实验组的CPM值分别为5722±561、4628±743、5287±785，与空白对照组的5986±459相比, 实验组的CPM值均降低，24小时实验组的CPM值降低最为显著（P<0.05），其抑制率分别为3.6%、22.7%和11.7%。
二、蜕膜细胞上清液对NK细胞活性的影响
空白对照组的CPM值为9 511±719，自发释放组的CPM值为534±40，最大释放组的CPM值为64747±893，培养12、24和48小时的实验组的CPM值分别为4836±293、6377±453和7 841±499，前两者与空白对照组相比，显著降低(P<0.05)。空白对照组的NK细胞杀伤率为14.0%，培养12、24和48小时的实验组的杀伤率分别为6.7%、9.1%和11.4%，其抑制率分别为52.3%、34.9%和18.6%。
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