A第一链：①取2μg总RNA和1μg Oligo（dT）分别放入同一个1.5ml离心管中；②70℃水浴5min；③冰上急冷3min；④各管分别加入10mM dNTP 1.25μl、MMLV 1μl、RNA酶抑制剂0.75μl、反转录缓冲液5μl；⑤用DEPCH2O补齐至总体积为25μl，震荡、混匀后，离心；⑥42℃水浴60min；⑦70℃水浴15min；⑧-20℃保存备用。（2）PCR反应：利用PCR引物序列CRHR1α（sense：5TCCGCTACAATACCAACAA,antisense:5GCCGCAGAAAGAGGACAAA,扩增产物理论值约207bp）、CRHR2（sense:5AGAATGCTTGGAGAATGGGACG,antisense:5ACGACAAGGGCGATGCGGTA，扩增产物理论值约171bp）、gapdh（sense:5GACACCCACTCCTCCACCTTTGA,antisense:5CTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC，扩增产物理论值约189bp），测定有宫缩、无宫缩及未妊娠子宫下段平滑肌CRH受体和（或）亚型mRNA的表达水平。（3）反应体系（25μl）：dH2O 15.6μl；10倍扩增缓冲液2.5μl;25mM MgCl2 1.5μl;10mM dNTPs 1μl;10μM引物11μl;10μM引物21μl；cDNA产物2μl。95℃ 6min后，加0.4μl TaqDNA聚合酶（5u/μl）；95℃ 30s;55℃（CRHR1α）/58℃（CRHR2及gapdh）30s，72℃ 1min，30个循环后，72℃ 10min。
1.4.4 实时PCR定量分析 采用浓度逐渐递增的子宫肌层细胞cDNA，作为相对已知浓度的cDNA，在实时PCR中分别作为CRHR1α和CRHR2的标准品，同时扩增样本，应用Rotorgene5软件绘制标准曲线，以该标准曲线相对定量样本cDNA浓度，用CRHR1α和CRHR2与GAPDH的相对cDNA浓度比值反映CRHR1α mRNA和CRHR2 mRNA表达量。
1.5 统计学方法 所有数据均以中位数±四分位间距表示。以SPSS 10.0软件进行ANOVA方法行两独立样本方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 实验结果
2.1 子宫肌组织mRNA甲醛变性凝胶电泳 见图1。
图1 子宫肌组织mRNA甲醛变性凝胶电泳 略
2.2 子宫肌组织gapdh RT-PCR产物的琼脂凝胶电泳 见图2。
2.3 子宫肌组织CRHR1 RT-PCR产物的琼脂凝胶电泳 见图3。
2.4 子宫下段肌组织CRHR2 RT-PCR产物的琼脂凝胶电泳 见图4。
图2－图5 略
2.5 实时定量PCR结果 （1）未妊娠子宫肌中CRHR1 mRNA显著高于足月有宫缩、无宫缩子宫（P＜0.05）；足月妊娠有宫缩、无宫缩子宫肌中CRHR1α mRNA表达无明显差异（P＞0.05）（见图5）。（2）妊娠妇女子宫肌中CRHR2 mRNA水平较未妊娠时显著降低（P＜0.01）；足月有宫缩、无宫缩子宫肌中CRHR2 mRNA表达无明显差异（P＞0.05）（见图6）。
图6 略
3 讨论
随着分娩启动机制的研究进展，人类生殖系统中CRH及其受体的研究越来越受到关注。CRH受体（CRHR）是一种G蛋白耦联受体。目前已知三种CRH受体：CRHR1（1αh）［3］和CRHR2（2α，2β和2γ），2001年在二倍体catfish中发现了第三种CRH受体（CRHR3）［8］。在人类子宫肌层中发现有CRH R1和R2受体。胎盘中表达CRHR1，而不表达CRHR2 mRNA［7］。
既往人们发现妊娠子宫中存在CRH受体1α、1β、2γ和变异的C［9］，非妊娠子宫中存在1α和1β［6］。子宫下段CRHR1 mRNA妊娠期下降，分娩时显著升高；宫底无变化。CRHR1、CRHR2蛋白定位于未妊娠及分娩子宫平滑肌上。妊娠子宫中，CRHR定位于平滑肌及纤维原细胞中［5，7］。
在本研究中，与未妊娠子宫相比，足月妊娠无宫缩、有宫缩子宫肌中CRHR1α mRNA、CRHR2 mRNA显著降低（P<0.05），足月
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