hTERC基因扩增与宫颈病变的相关性研究

　　【摘要】 目的：探讨人端粒酶基因( human telomerase gene, hTERC)基因扩增与子宫颈癌发生及发展的关系。方法：收集100例宫颈细胞涂片根据细胞形态学检查结果将涂片分类，应用荧光原位杂交技术(FISH)技术对分类不同的涂片进行hTERC基因的检测，以探索hTERC基因扩增与不同细胞形态学改变的关系。结果：通过100例标本的检测发现，正常或炎症组26例，出现基因扩增5例，扩增率为19.25 %;CINⅠ组检测37例，8例扩增，扩增率为21.6 %;CINⅡ组检测23例，14例扩增，扩增率为60.8 %;CINⅢ组检测12例，9例出现扩增，扩增率为75.0 %;宫颈癌2例均扩增。结论：hTERC基因高表达在子宫颈癌发生、发展中可能起重要作用，在子宫颈病变脱落细胞中检测hTERC扩增可以帮助确定低分化病变的高风险，可以作为子宫颈癌早期筛查、病情监测和评估预后的辅助指标。

　　【关键词】 FISH技术;hTERC基因;宫颈病变

　　在世界范围内，宫颈癌仍然是严重威胁妇女健康的主要恶性肿瘤之一。发病率居女性生殖系统恶性肿瘤的第二位，每年全世界大约有49.3万的新发病例，在中国每年有约12万新发病例[1]。宫颈癌的发生和发展是一个多基因、多因素、由渐变到突变的过程。近年有研究表明宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增,其中涉及到最重要的基因是hTERC[2], hTERC基因定位在3q26.3。本研究采用FISH方法检测不同程度子宫颈病变脱落细胞中hTERC基因的表达，探讨hTERC基因高表达在子宫颈癌发生、发展中可能起的重要作用，以及对于预测子宫颈病变的进展和不良预后的意义，为临床子宫颈癌的筛查、诊断提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 收集内蒙妇幼保健院2008年4月至2008年12月宫颈门诊和住院患者的子宫颈脱落细胞100 例，其中CINⅠ37例、CINⅡ23例、CINⅢ 12例、浸润性子宫颈癌初诊患者2例，所有病例均未接受任何治疗。26例正常或炎症子宫颈脱落细胞取自常规体检妇女，临床检查无异常，脱落细胞学检查阴性;病变标本均有病理检查证实。

　　1.2 细胞标本 用液基薄层细胞学宫颈刷插入宫颈口, 在宫颈外口鳞柱状上皮交界处, 以宫颈外口为中心, 均匀旋转3～5周, 取出宫颈刷放入TCT小瓶里，待TCT涂片后的剩余液体移入15 mL离心管里1 000 rpm离心5 min弃上清，收获宫颈脱落细胞。

　　1.3 主要试剂 所用FISH探针由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供TERC/CSP3 DNA双色探针。hTERC基因标记在3q26.3位点, CSP3 DNA标记在3号染色体着丝粒处(3p11-q11), 分别用红色(Rhodamine) 和绿色( FITC) 标记,以CSP3探针作为对照。

　　1.4 研究方法

　　1.4.1 样本玻片预处理 取5～10 mL采集的细胞样本在1 000 rpm下离心10 min后，弃上清。加入5 mL胶原酶B，置于37 ℃水浴20 min。离心后弃上清。加5 mL去离子水置37 ℃水浴40 min，卡诺固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定3次。滴片，56 ℃老化30 min。

　　1.4.2 标本变性及杂交 玻片在2×SSC中漂洗2次。室温下于0.1 M HCl溶液中浸泡玻片10 min。2×SSC中漂洗2次。20 mg/mL胃蛋白酶溶液消化10 min，2×SSC漂洗2次，依次置于-20 ℃预冷的70 %、85 %、100 %乙醇进行梯度脱水，自然干燥后，将玻片在预热的变性液(70 %甲酰胺/2×SSC)中浸泡5 min。依次置于-20 ℃预冷的70 %、85 %、100 %乙醇进行梯度脱水。自然干燥后，置45～50 ℃烤片机上预热2～5 min后与探针杂交。

　　1.4.3 标本杂交 将探针混合物置于73±1 ℃水浴箱中变性5 min后，将混合物置于45～50 ℃水浴箱20 min,杂交前取出。将10 μL变性后的探针混合物滴于玻片杂交区，立即加盖盖玻片(20 mm×20 mm)，用封片胶封边。玻片置于预热的湿盒中，42 ℃保温箱中过夜杂交。

　　1.4.4 玻片洗涤 移去盖玻片，立即将玻片置于盛有50 %甲酰胺/2×SSC溶液中洗涤3次，在2×SSC溶液洗涤一次，在2×SSC/0.1 %NP-40洗液洗涤，将玻片室温浸泡在70 %酒精3 min。

　　1.4.5 观察及结果判定 暗处自然干燥玻片。将15 μ

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