含survivin启动子重组的条件复制腺病毒联合顺铂对卵巢癌株HO 8910体外作用的实验研究

　　1 材料和方法

　　1.1 实验材料 卵巢癌细胞株HO-8910 购于中国科学院上海细胞所，RPMI 1640培养基购自美国Gibco 公司，小牛血清购自Hyclone公司，青霉素、链霉素、CDDP、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、RNA酶、dNTP等均购自美国Sigma公司，CRAd-survivin-RGD4C 条件复制病毒质粒由美国阿拉巴马癌症基因研究中心的朱正卞教授惠赠。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养 HO-8910 细胞贴壁生长在含有10%新生胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基中，细胞培养在 5 % CO2、37℃条件下进行。

　　1.2.2 CRAd的繁殖、纯化、滴度测定、转导效率测定 参照文献[3]进行。

　　1.2.3 细胞实验 将1.0×103个/孔的 HO-8910细胞接种到96孔板中，分别进行如下实验。①CRAd实验：24 h 后分别转染不同浓度(0、 0.01、0.1、1、10和100 pfu/cell)的CRAd，2 h 后换新鲜的培养基。②CRAd+CDDP实验：不同浓度CRAd转染HO-8910细胞实验同上，24 h后加入10 mg/L 的CDDP，孵育24 h，换新鲜的培养基后继续培养。③CDDP实验：24 h 后加入10 mg/L CDDP。④阴性对照实验：不加入CRAd、CDDP，仅以磷酸盐缓冲液(PBS)替代(PBS组)。以上实验各浓度组各设3个复孔。

　　1.2.4 细胞活力检测 应用MTT法，分别于细胞培养的第2、4、6、8、10天取样进行检测。收集细胞后加入 10 g/ L MTT 20 μl，同样条件继续培养 4 h，吸出培养液，加入 200 μl 二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解 10 min , 放入全自动酶标仪，上机检测光密度(D) 值。阴性对照调零，测定波长为 490 nm。细胞存活率(%)=实验组D值/ 阴性对照组D值×100 %。

　　1.2.5 细胞凋亡检测 各组细胞培养10天后，应用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。收集处理后的细胞，以1000 r/ min 离心 5 min，弃上清液， PBS洗涤2遍, 细胞重新悬浮于PBS中，调整细胞浓度为 1.0×106 个/ L，70 %乙醇固定，4℃过夜后加入 1 ml PI 染液〔50 mg/L PI，20 mg/ L RNA酶，10 ml/L屈立通X2100，1 g/L枸橼酸钠(pH 值7.12～7.14)〕，4℃避光染色 30 min，上流式细胞仪检测细胞核DNA含量。多功能软件系统分析测定结果。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0 软件进行统计分析，各组间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度CRAd对肿瘤细胞的抑制作用 经MTT检测，各时点不同浓度的CRAd对于卵巢癌HO-8910细胞有程度不同的抑制，以第8、10天较为明显;当CRAd浓度达到1 pfu/cell 以上时对卵巢癌HO-8910细胞才有明显的抑制效应，即CRAd对卵巢癌HO-8910细胞的抑制作用具有剂量依赖性。见图1。

　　图1 不同浓度CRAd处理后HO-8910细胞存活情况

　　2.2 CRAd+CDDP对肿瘤细胞的抑制作用 不同浓度CRAd+CDDP及单独CRAd、CDDP实验结果显示，各浓度CRAd+CDDP对卵巢癌HO-8910细胞的抑制率较CRAd、CDDP的单独作用均有明显提高，其中以10 pfu/cell 的CRAd联合CDDP处理效果最佳;10 pfu/cell CRAd +CDDP对肿瘤细胞的抑制效率与100 pfu/cell CRAd 接近，说明联合处理可以降低病毒的用量。10 pfu/cell CRAd+CDDP及10 pfu/cell CRAd、10 mg/L CDDP单独处理结果比较见图2。

　　图2 不同方法处理后HO-8910细胞存活率

　　2.3 肿瘤细胞的凋亡 细胞凋亡检测结果显示，CRAd(10 pfu/cell)组、CDDP组及CRAd(10 pfu/cell)+CDDP组的凋亡率与PBS组相比均有明显提高，而CRAd+CDDP组的凋亡率又明显高于CRAd组及CDDP组。见图3。

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