reaction; tandem repeat sequences
产前诊断是预防遗传病的重要手段。目前，产前诊断所使用的材料一般是通过羊膜穿刺术等损伤性手段获取,这些方法对母儿有一定的危险性。孕妇外周血中胎儿细胞的发现为非损伤性产前诊断带来希望，但仍存在操作复杂、仪器试剂昂贵、胎儿细胞含量低等一些无法克服的问题，限制了其在临床产前诊断中的应用。1997年有学者发现在母体血浆中存在着游离胎儿DNA[1],这一发现为非损伤性产前诊断开辟了新的途径。本研究以母体血浆中提取的DNA为材料，通过PCR扩增Y染色体上的特异序列检测胎儿DNA的存在及其消长规律,并应用21号染色体的4个短串联重复序列(STR)位点为遗传学标记，检测孕妇外周血浆中的胎儿父源特异性序列,以鉴定女性胎儿DNA的存在。
1 对象和方法
1.1 对象
选择2002年3～12月在青岛市市立医院、青岛市计划生育研究所就诊的不同孕周(6～40周)孕妇63例，各取外周血2 mL(ACD抗凝)，孕妇年龄24～30岁。其中，孕早期18例，孕中期30例，孕晚期15例。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 按常规分离孕妇外周血浆，血浆中游离基因组DNA的提取按UNIQ10DNA柱式抽提试剂盒说明书进行。
1期王修海，姜晓静，纪向虹.孕妇血浆胎儿DNA检测及其在产前诊断中的应用29
1.2.2 PCR引物 PCR试剂和DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。引物名称及序列见表1。表1 引物名称及序列
1.2.3 孕妇血浆胎儿DNA的SRY基因扩增 采用PCR技术。50 μL反应体系包含：10×Buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)8 μL，引物(109F、245R)各300 nmol/L，4×dNTP(10 mmol/L)200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，样本DNA 5 μL，去离子水20.75 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个循环;72 ℃延伸10 min。每次扩增均设阳性和阴性对照。
1.2.4 孕妇血浆胎儿DNA多态位点的PCR扩增25 μL反应体系内含有：10×Buffer 2.5 μL，4×dNTP(10 mol/L)0.3 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，引物D21S11、D21S1411、D21S1412、D21S1414 F、R(10 μmol/L)各2.0 μL，样本DNA 5 μL，Taq DNA聚合酶1.5 U，去离子水11.4 μL。PCR反应程序：94 ℃ 10 min;94 ℃ 48 s;60 ℃ 48 s，72 ℃ 1 min，40个循环;72 ℃延伸10 min。
1.2.5 PCR产物的检测 分别取5 μL PCR产物在60 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=29∶1;离子强度为1×TBE)中电泳，200 V、25 mA室温下电泳1.5 h。凝胶用硝酸银染色，照相记录。根据电泳条带进行实验结果分析。
2 结 果
2.1 不同孕周的孕妇外周血浆SRY基因检测
胎儿出生后证实63例胎儿中33例为男胎，30例为女胎。在33例男胎妊娠的孕妇外周血浆中检测到SRY基因，不同妊娠时期检出率分别为：孕早期72.7%(8/11)、孕中期90.9%(10/11)、孕晚期100%(11/11)。而在30例女胎妊娠的孕妇外周血浆中未检测到SRY基因。该方法最早可于孕7周检测出该基因，分娩后2 h内检测不到(图1)。
2.2 孕妇外周血胎儿DNA各STR位点的多态性检测
不同位点可扩增出胎儿特异性等位基因的比例不同。63例中51例在D21S11位点出现结果(孕早期10例，孕中期27例，孕晚期14例);49例在D21S1411位点出现结果(孕早期9例，孕中期26例，孕晚期14例);16例在D21S1412位点出现结果(孕早期2例，孕中期8例，孕晚期6例)。D21S1414位点48例出现结果(孕早期10例，孕中期27例，孕晚期14例)。63例标本经4对引物扩增均可检测到胎儿父源性特异等位基因(图2)。
3 讨 论
1977年LO等[1]首先报道了在孕妇血浆中存在胎儿DNA。此后又有一些学者通过PCR技术扩增Y特异性DNA序列证明孕妇血浆中胎儿DNA的存在，并对胎
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