人宫颈癌FHIT基因的表达改变与HPV16感染的关系

　　1.2.3 总RNA的提取

　　采用TrizoL试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA，于紫外分光光度计(美国Bio-RAD公司) 测波长分别为260 nm和280 nm的吸光度(A)值，选用A260/A280为1.8-2.0的样本用于RT反应。

　　1.2.4 cDNA的合成

　　采用大连宝生物工程有限公司生产的RNA反转录试剂盒，按说明书操作。电泳检测cDNA图像呈明显片状者用于PCR扩增，并于-20 ℃保存备用。

　　1.2.5 FHIT基因扩增

　　采用大连宝生物工程有限公司生产的PCR试剂盒进行巢式PCR扩增，第一轮和第二轮扩增反应体系均为50 μL，含试剂盒反应液15 μL，FHIT基因引物和β-actin上、下游引物各20 pmol，加灭菌水至50 μL，用PE 2400型扩增仪完成PCR扩增，两轮扩增条件均为：94 ℃预变性2 min后，94 ℃变性30 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。

　　1.2.6 回收和纯化FHIT的转录片段

　　随机选取扩增异常FHIT基因的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳后切下含有目的DNA条带，用大连宝生物工程有限公司生产的纯化试剂盒纯化，由上海博亚生物工程公司进行产物测序。

　　1.2.7 HPV16基因扩增

　　采用美国Omega公司试剂盒提取宫颈癌细胞及组织DNA，测定A260/A280值并计算DNA浓度，1-5 μg的DNA用于PCR扩增，检测HPV16 DNA。

　　1.2.8. 统计学处理

　　采用SPSS10.0进行统计分析，数据采用χ2检验，设定α=0.05为统计检验的显著标准。

　　2 结 果

　　2.1 FHIT基因mRNA的表达

　　5种人宫颈癌细胞株均可检测出FHIT基因，其中CS1213和RJC-1细胞中为正常的基因转录片段，SiHa、HeLa和C4-1细胞中为截短的基因转录产物。宫颈癌患者中有FHIT基因表达片段异常者39例(67.2%)，正常对照组无1例(0%)，两组之间有显著性差异(表2)。表2 宫颈癌和正常宫颈组织中FHIT基因表达改变和HPV16感染的关系(略)

　　2.2 HPV16DNA的检测

　　宫颈癌细胞株SiHa、RJC-1有HPV16感染;宫颈癌患者中HPV16感染者37例(63.8%)，正常对照组1例(5%)，两组比较存在显著性差异P<0.05)。宫颈癌组织中有HPV16感染患者的FHIT基因表达异常数为30/37，显著高于HPV16未感染的患者(9/21)，FHIT基因表达异常和HPV16感染之间有相关性(χ2=8.886, P<0.01)。

　　2.3 FHIT基因异常和HPV16感染与宫颈癌患者的临床分期、病例分级和淋巴节转移的关系

　　不同年龄、病理分级、肿瘤直径、临床分期及盆腔淋巴结转移与否的宫颈癌组织中FHIT基因转录异常片段分别进行比较，差异均无显著性(表3)。 表3 FHIT基因异常和HPV16感染与宫颈癌患者的临床指标的关系(略)

　　2.4 FHIT基因DNA测序的结果

　　FHIT基因转录本的改变主要是外显子缺失, 异常序列包括：第4到第9外显子之间出现缺失片断，即缺失第5、第6、第7外显子;第3到第8外显子出现缺失片断，即缺失第4、第5、第6、第7外显子;第4到第9外显子，即缺失第5、第6、第7、第8外显子;第4外显子的缺失，即从第3到第5外显子。测序未发现插入序列和点突变(图1、图2)。

　　3 讨 论

　　本研究通过检测FHIT基因在正常宫颈上皮和鳞状细胞癌中的转录改变，从而探讨FHIT基因mRNA表达异常对人宫颈鳞癌发生、发展的影响。结果发现FHIT基因在正常宫颈组织中均有低水平表达，而在宫颈癌衍生细胞株和宫颈癌组织中存在高频率的FHIT基因的表达异常，主要为明显的、连续的大片段的缺失。提示FHIT基因的改变可能在宫颈癌的发生中起重要作用。异常FHIT转录产物多集中在350 bp和400 bp大小，与Teresa等[6]研究结果类似，经测序证实主要是外显子5、6、7和外显子4、5、6两种类型的缺失所致。FHIT基因外显子5中包含有FHIT基因O

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