ygenase-2, COX-2)是炎症反应中催化前列腺素合成的一个限速酶。有研究发现COX-2在结肠癌、食管癌、宫颈癌中表达升高，其表达同免疫抑制、血管生成、抗凋亡和细胞增殖有关，影响肿瘤的发生发展[1-3]。ki-67抗原为细胞分裂增殖相关蛋白，可识别生长中的细胞，评估细胞增生[4]。本研究通过检测COX-2和ki-67在宫颈正常组织、慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)、宫颈鳞状细胞癌(squamous carcinoma of the cervix, SCC)中的表达，探讨COX-2在宫颈癌发生发展中的作用和机制。
1 材料与方法
1.1 标本来源与分组
实验分2组，实验组均取自西安交通大学医学院第二附属医院2005年11月至2006年3月手术切除并经病理学证实的标本。其中宫颈癌组30例，患者年龄32-72岁，平均(44.23±8.85)岁;对照组包括，慢性宫颈炎10例，患者年龄29-43岁，平均(30.58±10.25)岁;CIN 10例，患者年龄37-50岁，平均(46.50±3.94)岁;正常宫颈10例，患者年龄29-43岁，平均(37.52±6.84)岁。所有病例术前2 周内均未服用消炎痛、阿斯匹林等影响前列腺素代谢的药物。采得的新鲜组织2份，1份液氮处理后，-80 ℃冰箱冻存以备RT-PCR检测，另1份4%(体积分数)甲醛溶液固定，石蜡包埋，以备免疫组化染色。
1.2 RT-PCR法及结果判定
β-actin(303 bp)用于内对照，PBS液代替引物作为阴性对照。总RNA提取后，紫外分光光度计(美国Nano Drop ND-100 Spectrophotometer仪)检测RNA纯度(>1.6)，计算出RNA浓度，取2 μg进行RT-PCR。引物设置：COX-2(530 bp)上游引物：AAGCCTTCTCTAACCTCTCC;下游引物：TAAGCACATCGCATACTCTG;β-Actin(303 bp)上游引物：AGCGGGAAATTGTGCATG;下游引物：CAGGGTACCTGGTGGTGCC(由陕西理生医疗科技有限公司合成)。在同一反应体系，按照RT-PCR酶混合物试剂(陕西理生医疗科技有限公司)说明结合参考文献[5]提供的逆转录系统及参数进行RT-PCR：37 ℃反应30 min，95 ℃ 3 min灭活逆转录酶后95 ℃变性30 s，57.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反应30个循环。取扩增产物进行0.5 mg/L琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。用凝胶成像系统进行半定量分析(美国Bio-Rad凝胶成像分析仪，型号：Gel Doc EQ)，取目的基因条带和β-actin条带强度的比值作为目的基因的相对值。
1.3 免疫组化染色及结果判定
常规切片(4 μm)，脱蜡，柠檬酸沸水修复抗原，其余步骤按SP免疫试剂盒(北京中山试剂公司产品)说明操作。抗COX-2多克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体购自北京中山试剂公司，工作浓度分别为1∶1 200，1∶200。用已知膀胱癌阳性片作阳性对照，PBS液代替一抗作阴性对照。结果判断：COX-2阳性染色主要为胞质，少数为核膜着色。ki-67阳性染色主要为胞核和核膜着色。免疫组织化学标本经Image-proplus图像分析软件进行图像分析[6]，每个标本随机选取3个高倍视野，测定单位面积下平均灰度值，最后求每张切片的平均灰度值及标准差。本次测量灰度值标准，极白为255，极黑为0，共256阶。故染色越浅，灰度值越大;染色越深，灰度值越小，考虑背景色的误差，将灰度值≥200者视为阴性。
1.4 统计学处理
所有数据用SPSS 11.5统计软件处理。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组间均数比较根据方差是否齐性采用t或t′检验，等级资料采用Spearman相关系数分析，两组计量资料之间的关系采用Pearson相关系数分析，P<0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 COX-2 mRNA和蛋白的表达
COX-2蛋白在正常组无表达，炎性、CIN组、SCC组表达依次升高，与正常组比较具有统计学差异(P<0.05)，但病变各组间无统计学差异(P>0.05，表1)。宫颈病变各组COX-2蛋白表达阳性率增高。COX-2 mRNA在正常组不表达，宫颈病变各组表达升高(图1)，但与蛋白表达不完全一致(r=0.135，P=0.68)。表1
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