卵巢癌细胞系来源外来体的获得及形态特征观察

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 RPMI1640培养液购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司;99.93%重水购自四川火炬化工集团有限责任公司;Centriplus离心超滤管(100KDa)、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超滤离心管(100KDa)购自美国Millipore公司;超速低温离心机(美国Beckman公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肿瘤细胞的复苏 将装有肿瘤细胞混悬液的冻存管从液氮罐中取出后直接投入设置温度为37℃的快速恒温数显水箱中，不时摇动使其融化。在超净工作台中，用750mL/L乙醇消毒冷冻管外周;打开冷冻管，用吸管吸出细胞悬液至离心管，加15mL含100mL/L胎牛血清RPMI1640完全培养基混匀，水平离心100g×10min，洗涤2次，吸弃上清;加入新鲜培养液，细胞计数板计数，使细胞最终浓度为5×105/mL，接种于培养瓶中，放至37℃含50mL/L CO2饱和湿度细胞培养箱中常规培养。第2天换液，水平离心100g×10min，继续原条件下培养，及时传代。

　　1.2.2 细胞培养 SKOV3、8910、TC1、CAOV和3AO 5种细胞系均置于含2mmol/L L谷氨酰胺和青、链霉素各100U/mL，100mL/L胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中，于37℃含50mL/L CO2细胞培养箱中常规培养，隔日传代，待细胞生长至对数期，用2.5g/L胰蛋白酶消化收集细胞，用PBS洗涤重悬，调整细胞浓度为1×107/mL。所有实验均用对数生长期的细胞。

　　1.2.3 外来体的获得 以300×g离心5min，取上清液;以800×g离心30min，去沉淀;再以10000×g离心40min，取上清液;加入Centriplus超滤离心管(100K)中，以1500×g离心1h，取浓缩液。将30g/L的蔗糖/重水垫3mL、浓缩液3mL和0.01mol/L PBS 4mL依次放入离心管中，低温下以100000×g超速离心1h。取出混有外来体的蔗糖/重水垫，0.01mol/L PBS悬浮，加入Amicon Ultra高回收率高流速切向流超滤离心管(100ku)中以1500×g离心30min，重复3次。取浓缩液用0.01mol/L PBS悬浮成5mL，为原液。置于4℃冰箱中保存备用。

　　1.2.4 外来体的形态观察 取20μL外来体原液滴于载样铜网上，于室温静置1min;用滤纸从侧面吸干液体，滴加20g/L磷钨酸(pH6.8)约30μL于铜网上，室温负染1min;用滤纸吸干负染液，在白炽灯下烤干后，于透射电镜下观察，并照相。

　　2 结果

　　8910、3AO细胞系培养上清液中分离出外来体，TC1、SKOV3和CAOV细胞系培养上清液中未分离出外来体。两种细胞系来源的外来体在形态和大小上无明显差别(图1a，1b)。透射电子显微镜下观察，可见具有明显异质性的圆形或椭圆形小囊泡，直径约30-90nm，有完整的包膜，内为低电子密度物质(图1a,1b)。

　　图1 电镜下来源于8910卵巢癌细胞系(a)和3AO卵巢癌细胞系(b)的外来体(×120000)(略)

　　Fig.1 Exosomes derived from 8910 ovarian cancer cell line (a) and 3AO ovarian cancer cell line (b) in electron microscopy(×120000). Exosomes were not distinct difference in morphology and diameter in two figures. They exhibited characteristic round or elliptic microvesicles ranging from 30 to 90 nm in diameter with intact membrane, in which there were low electron density substance.

　　3 讨论

　　肿瘤细胞疫苗存在下列缺点：①取材受限，必须有新鲜

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