染胎儿[2]，但具体机理现仍不清楚。HBV感染肝脏的研究表明，HBV也同其他的病毒一样 ，首先通过病毒外膜蛋白识别肝脏细胞质膜上的受体[3]，和靶细胞上的受体结合，附着于细胞表面，在病毒受体的介导下，进入细胞进行复制。有研究发现人膜联蛋白V(Human Annexin V, HAV)是肝细胞膜上与HBV感染有关的受体[4]。并且在胎盘组织中也检测到HAV[5]，那么HBV感染胎盘各类细胞是否也与HAV有关?为此，我们对正常的不同孕期胎盘和足月HBV感染的胎盘中HAV及HBsAg表达应用免疫荧光双标记技术进行检测，以了解其分布和相互关系，并探讨HAV在HBV感染胎盘中的可能作用。
1 材料与方法
1.1 材料 2003年3月至2004年3月，收集在西安交通大学第一医院住院分娩的产前检查及复查血清中HBsAg阳性(其中大三阳12例，小三阳15例)孕妇足月分娩胎盘27例。同时随机收集3例HBV血清标志物阴性的正常足月胎盘;另外取人工流产及住院治疗性中期引产的HBV血清标志物阴性的孕妇绒毛和胎盘各3例。鼠抗人乙肝病毒表面抗原(HBsAg)单克隆抗体(一抗)、FITC标记兔抗山羊IgG(二抗)、罗丹明标记山羊抗小鼠IgG(二抗)购于北京中山生物技术有限公司。山羊抗人膜联蛋白V(Annexin V)多克隆抗体(一抗)，购于Santa Cruz 生物技术公司。
1.2 方法 取新鲜全层胎盘组织，大小为2cm×1cm×0.5cm，生理盐水洗去沾染的血液(末次洗后上清用PCR及ELISA未检测出HBV标志物)， 40g/L多聚甲醛固定24h;绒毛则直接用生理盐水冲洗后以40g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片备用。
1.2.1 Human Annexin V免疫荧光染色 ①常规脱蜡至水;②H2O2 37℃ 15min封闭内源性过氧化物酶;③正常兔血清37℃ 30min封闭非特异性蛋白;④滴加1∶50稀释的山羊抗人膜联蛋白V多克隆抗体，4℃过夜;⑤滴加1∶100稀释的FITC标记的兔抗山羊IgG，37℃ 1h，以上各步间均用PBS冲洗，5min×3次;⑥缓冲甘油封片，荧光显微镜观察。激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)上观察并拍照。用于FITC的激发波长为495nm。用PBS取代山羊抗人膜联蛋白V多克隆抗体作为空白对照。
1.2.2 HBsAg和Human Annexin V免疫荧光双标染色 经SP免疫组化法检测出22例胎盘HBsAg阳性，用免疫荧光双标染色观察胎盘组织中HBsAg和Human Annexin V的分布。①切片常规脱蜡至水;②加入尿素，室温30min后，蒸馏水洗1次;③加1∶50稀释的鼠抗人乙肝病毒表面抗原单克隆抗体和1∶50稀释的山羊抗人膜联蛋白V多克隆抗体，4℃过夜;④滴加1∶100稀释的TRITC标记的山羊抗鼠IgG和1∶100稀释的FITC标记的兔抗山羊IgG，37℃ 1h;⑤无荧光缓冲甘油封片。以上各步间均为PBS洗5min×3次。在型号为LeiCaTCS SP2的激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)上观察并拍照。FITC的激发波长为495nm，TRITC的激发波长为546nm。
1.3 结果判断标准 HBsAg阳性部位发红色荧光，Human Annexin V阳性部位发绿色荧光，HBsAg和Human Annexin V的重叠处发黄色荧光。
2 结果
2.1 不同孕周胎盘Human Annexin V的表达和分布 应用免疫荧光染色方法检测血清HBsAg阴性早孕绒毛3例、中期引产胎盘3例、足月胎盘3例和血清HBsAg阳性的足月孕妇娩出的胎盘3例Human Annexin V的表达、分布。发现无论妊娠时间长短、感染HBV与否，所有标本的绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、间质内血管内皮细胞都有Human Annexin V的表达(图1)。空白对照未显示阳性信号。
图1 免疫荧光染色绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、间质内毛细血管内皮细胞HAV阳性表达呈绿色荧光(略)
Fig.1 Immunofluorescence staning of HAV in trophoblastic cells, villous mesenchymal cells and villous capillary endothelial cells, HAV positive is in green (10×40)
2.2 HBsAg和Human Annexin V在胎盘的分布 对HBsAg阳性的22例胎盘组织采用免疫荧光双标染色方法检测HBsAg和Human An
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