基质金属蛋白酶抑制基因RECK在早孕自然流产绒毛组织中的表达及意义

　　MMP-2引物：上游引物为5′-CGC-TCA-GAT-CCG-TGG-TGA-GA-3′，下游引物为5′-TGT-CAC-GTG-GCG-TCA-CAG-T-3′。PCR反应条件同RECK。

　　β-actin引物：上游引物为5′-AGC-GAG-CAT-CCC-CCA-AAG-TT-3′， 下游引物为5′-GGG-CAC -GAA-GGC-TCA-TCA-TT-3′。PCR反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s和72℃延伸45 s，28个循环，72℃延伸5 min，补平PCR产物的延伸末端。

　　PCR反应体系为20 μl，反应产物经含0.5 mg/L EB的2.5%琼脂凝胶电泳，于UVIpro凝胶图像分析系统下观察并摄像，用Image J软件扫描分析扩增条带，以目的基因条带的灰度值与β-actin条带灰度值的比值作为目的基因mRNA的相对含量。

　　1.2.3 Western blotting法检测蛋白质 上述绒毛标本按Trizol说明书操作抽提浓缩得到蛋白样本,用改良Lowry法测定蛋白浓度(g/L)。蛋白样本经SDS-PAGE电泳后(采用7%分离胶),半干法转移至硝酸纤维素膜, 封闭液中室温下水平摇床封闭1 h,加入一抗(兔抗人MMP-2及RECK蛋白抗体为cell-singaling公司产品，羊抗人MMP-9蛋白抗体为美国Santa 公司产品，1∶500), 4℃过夜,弃去含有一抗的封闭液,硝酸纤维素膜置平皿加入适量TBST洗涤5 min,更换TBST重复洗3次,加入荧光二抗(鼠抗兔、兔抗羊，稀释度为1∶100), 37℃ 1 h后,弃去二抗,TBST洗涤5 min,重复3次。奥德赛系统上成像及Image J分析系统处理,以目的蛋白条带的灰度值与β-actin条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对含量。

　　1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据用±s表示,2组间均数比较采用t检验,相关性分析采用Pearson方法，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 2组绒毛组织中RECK、MMP-2及MMP-9的mRNA表达 流产组绒毛组织中RECK mRNA表达高于对照组(P<0.05),而MMP-9和MMP-2的mRNA表达低于对照组(P<0.05)。见表1、图1。

　　2.2 2组绒毛组织中RECK、MMP-2及MMP-9蛋白表达 Western blotting分析显示流产组绒毛组织中RECK蛋白含量高于对照组(P<0.05)，而MMP-9蛋白及MMP-2蛋白的含量显著低于对照组(P<0.05)。见表2。表1 2组绒毛组织中RECK、MMP-2及MMP-9的mRNA表达比较表2 2组绒毛组织中RECK、MMP-2及MMP-9蛋白含量比较

　　2.3 RECK与MMP-2、MMP-9之间的相关性 经Pearson相关性分析发现，RECK蛋白与MMP-2蛋白之间有明显的负相关性(r=-0.735，P<0.05),RECK蛋白与MMP-9蛋白之间亦存在明显的负相关性(r=-0.755，P<0.05)。

　　3 讨 论

　　ESA是人类最常见的异常妊娠，发生率占全部自然流产的80%以上[3]。且近年发病率呈上升趋势，目前其发病机制尚未完全阐明。

　　成功的妊娠依靠绒毛外滋养细胞向母体子宫壁迁移，浸润螺旋动脉血管，使之转化为膨大松弛的血管，为胎儿发育提供氧和各种生长条件。绒毛外滋养细胞不能充分浸润、重铸螺旋动脉是自然流产、妊娠高血压疾病、胎儿宫内生长受限等病理妊娠的发病相关因素。然而绒毛外滋养细胞的浸润调节机制仍不明确。

　　胎盘形成过程中, 绒毛外滋养细胞对子宫蜕膜的侵入以及对子宫螺旋小动脉的“血管重铸”是胎盘建成的关键环节。早期妊娠的胚胎组织与恶性肿瘤的生物学行为十分相似，两者的浸润机制有很多共同之处，尤其表现为细胞外基质(extracellular matix,ECM)的降解和重建。但胚胎绒毛的侵袭性仅限于子宫内膜和肌层的浅1/3，且于妊娠10周左右达到高峰，于妊娠中期停止。这种高度可控的侵袭特性，受多种机制的严格调控。目前已证明滋养细胞侵袭过程包括ECM的降解和重铸，滋养细胞侵入子宫蜕膜的过程受滋养细胞自分泌和子宫旁分泌的精确调控，如MMPs、整合素、胰岛素样生长因子(IGF)、尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)等均参与这一调控过程, 其中滋养细胞自分泌的 MMP-2和M

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