大豆胰蛋白酶抑制剂对人宫颈癌Hela细胞增殖的影响

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 药品和试剂

　　大豆胰蛋白酶抑制剂为北京中医药大学细胞与生化实验室提取(浓度为98%);RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品，胎牛血清为杭州四季青血清;胰蛋白酶和EDTA均购于Ameresco公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司;HERAD—6345型二氧化碳培养箱(德国赫利氏公司);IⅩ71倒置显微镜(日本奥林巴斯公司);FCANF129004酶标仪(澳大利亚TECAN公司)。

　　1.1.2 细胞株

　　人宫颈癌细胞株(Hela)由北京病毒学研究所惠赠。

　　1.1.3 培养液

　　RPMI1640全培养液(RPMI1640+10%胎牛血清+青链霉素100 U/mL及100 μg/mL)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 肿瘤细胞培养

　　Hela细胞使用含有10%胎牛血清的RPMI1640全培养液，在设定为37.0 ℃、5%CO2 培养箱中培养。细胞可贴壁生长，待细胞生长贴满底壁的80%左右时传代。传代时移去旧的培养液，用PBS洗涤2 次，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液消化，培养液重悬细胞于新培养液中，每瓶传代为2或3 瓶。取对数生长期细胞用于实验。

　　1.2.2 MTT法测定细胞生长

　　将用上述方法培养得到的细胞消化，l 000 rpm离心10 min，计数，以2×105个/L密度接种于96孔培养板中，每孔100 μL，在37.0 ℃、5% CO2 培养箱培养24 h后，加入浓度分别为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L 的 SBTI (溶解在含10%胎牛血清的1640全培养液中)100 μL。每一浓度各设6个平行孔，并分别设空白孔(即只加入药液和培养液，不加细胞)以调零。继续培养24、36、48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，再培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡器上震荡10 min，应用酶标仪于490 nm处测吸光值(A)，按照公式：抑制率%=(对照组A-实验组A)/对照A×100%，求抑制率。实验在相同条件下均重复进行3 次。

　　1.2.3 光镜下形态学观察

　　hela细胞接种于50 mL培养瓶中，培养24 h后，加入0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L的SBTI，培养24 h后，光学显微镜下观察细胞形态学变化，并拍摄照片。

　　1.2.4 统计学处理

　　数据利用SPSS13.0统计软件处理，求抑制率，采用重复测量的方差分析。并绘制出SBTI对Hela细胞抑制作用的量效和时效依赖关系曲线。

　　2 结果

　　2.1 SBTI对Hela细胞增殖的抑制作用

　　SBTI能够明显的抑制Hela细胞的增殖，并且呈现明显的量效和时效依赖关系。在不同的作用时间分别是24、36、48 h，随着药物浓度(为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L)的依次增加，抑制率依次增加，最高可达83.24%，87.83%，96.01%, 除了0.50 g/L与1.00 g/L组之间差异没有显著性(P>0.05)外，其他各组差异均有显著性(P﹤0.01);在不同的作用浓度(如上的6个浓度)，随着作用时间(24，36，48 h)的依次增加，抑制率也依次增加，除了0.50 g/L和1.00 g/L组的24 h与36 h比较差异没有显著性(P>0.05)外，其他的均有有显著性差异(P﹤0.01)，抑制率最高可达49.2%，59.77%,77.52%,80.92%,96.01%。见表1、图1。表1 不同浓度大豆胰蛋白酶抑制剂在不同作用时间对Hela细胞的抑制率(略)注：* 实验组与对照组比较P﹤0.01。#与前一组比较P﹤0.01,△与上一组比较P﹤0.01但是0.50 g/L与1.00 g/L两组间在24 h时差异没有显著性P>0.05, 0.50 g/L组的24 h与36 h比较差异没有显著性P>0.05，1.00 g/L组的24 h与36 h比较差异没有显著性P>0.05

　　2.2 SBTI对Hela细胞形态上的影响

　　正常培养时，Hela细胞在传代后陪培养3～4 h即可贴壁，呈现长椭圆形，10 h后贴壁结实，呈现多角形而且细胞大小不一，可见巨大细胞，胞质也多少不一，核大小不等

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