tological staging(P>0.05); the expression of HPV was associated with histological staging (P<0.05)，was not associated with lymph node metastasis ， UICC grading， recurrence (P>0.05); in the multivariate Cox analysis, survival rate was correlated with histological staging MMP2 CathepsinD (P<0.05). Conclution: MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin all take part in invasion of early cervical carcinoma; Histological staging MMP2, CathepsinD can be regarded as independent prognostic factors in early cervical carcinoma.
【KEY WORDS】 Cervical carcinoma;Invasion;Immunohistochemistry;CathepsinD;Prognosis
宫颈癌是目前危害女性健康的常见肿瘤，其局部浸润和淋巴结转移不仅影响手术效果，而且直接关系患者预后。宫颈癌的浸润转移机制尚不清楚，与预后关系研究较少;HPV感染与宫颈上皮的癌变存在密切联系。本实验利用免疫组织化学和原位杂交检测早期宫颈癌中MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin、HPV的表达，希望能为宫颈癌浸润机制的深入研究提供实验依据，并利用多因素Cox比例风险模型对其与早期宫颈癌患者的预后进行分析，为准确评估患者预后提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 一般资料
收集河北北方学院附属第一医院1985.1～1995.1月住院患者中临床病理资料齐全，并有10年以上随访结果的宫颈癌65例(随访时间至2004年1月，死亡病例均死于宫颈癌相关病变)，所有病例均为原发早期宫颈鳞状细胞癌，都进行了宫颈癌手术治疗，未作术后化疗、放疗等辅助治疗。年龄25～69岁，平均年龄51岁。无淋巴结转移21例，淋巴结转移44例。无局部复发42例，局部复发23例。按TNM分期标准进行临床分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期40例。资深病理医师对切片进行复习确诊，采用最新Reagan等建立的分类;大细胞非角化型癌(高分化)8例，角化型癌(中分化)39例，小细胞非角化癌(低分化)18例。
1.2 免疫组织化学染色
所有标本经10%甲醛常规固定,石蜡包埋,4μm连续切片。MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin一抗试剂均购自北京中山试剂公司。主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗(采用专用微波炉进行抗原微波热修复)，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗、三抗各1h，DAB显色10～15min，复染核脱水透明，中性树胶封片。结果判断:着色细胞<10%为阴性,>10%为阳性。MMP2、MMP9、CathepsinD阳性表达定位在肿瘤细胞质，Ecadherin阳性表达定位在细胞膜。采用HIPAS100图象分析软件对所有切片进行图象分析，每张切片随机选取5个着色典型区域且不重复的视场，测量每个视场中阳性单位，取其均数即为该切片的着色强度，所有的结果都以均数±标准差表示。
1.3 原位杂交染色
HPV16/18原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物试剂公司。主要步骤：切片常规脱蜡入水，3%H2O2室温处理10min，蒸馏水洗涤5min×3次;胃蛋白酶消化，37℃温箱中50min，PBS洗涤5min×3次;滴加预杂交液，40℃温箱中2h，吸取多余液体，不洗，滴加含探针的杂交液，盖专用盖片，40℃温箱中过夜;在37℃水浴中用2×SSC洗涤5min×2次，0.5×SSC洗涤10min×1次，0.2×SSC10min×1次;滴加封闭液，37℃温箱中30min，吸取多余液体，不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃温箱中60min，PBS洗涤5min×4次;滴加SABC，37℃温箱中30min，PBS洗涤5min×32007年2月张 凡等：早期宫颈癌局部浸润与临床预后关系的研究第1期2007年2月河北北方学院学报(医学版)第1期表1 MMP2、M
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