子宫内膜癌错配修复基因 的表达和启动子甲基化研究

　　两轮PCR反应体系都为30 μL。第一轮PCR的条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸30 s循环40次，72 ℃再延伸5 min。第二轮PCR的退火温度为61 ℃，循环25次。PCR产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并成像。第二轮PCR产物大小分别为115 bp (MSP)和124 bp (UMP)。

　　1.4 免疫组化

　　组织标本经福尔马林固定，石蜡包埋标本，制成4 μm的切片。将切片脱蜡，水化，浸入30 mL/L的H2O2溶液中，置于室温下10 min，封闭内源性过氧化酶。再置于pH 6.0的0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中，微波炉加热修复抗原。将切片置于5 mL/L的牛血清白蛋白中孵育5 min，减少非特异性染色。滴加第一抗体：鼠抗人hMLH1蛋白单克隆抗体 (购自Zymed laboratories Inc)约20 μL，工作浓度1∶50， 4 ℃孵育过夜。PBS洗涤，滴加生物素标记的第二抗体，置于37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，滴加过氧化物酶标记的链霉素抗生物素蛋白，置于37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，DAB显色。蒸馏水冲洗，苏木素复染。中性树胶封片显微镜下观察。

　　hMLH1蛋白产物表达特征：正常细胞hMLH1阳性表达主要定位于细胞核，呈棕黄色，而且各种病变组织中hMLH1基因产物的表达特征基本相同。每例均随机观察5个视野( × 200)，参照文献报道的判定方法进行计数：阳性着色细胞数≥10%为阳性表达，阳性着色细胞数<10%为阴性表达。在高倍视野下拍照( × 400)。

　　1.5 统计学方法

　　试验结果采用SPSS 11.0统计软件对所得数据进行分析。两种不同的组织标本进行比较， 采用Chi-square检验或Fisher精确概率检验进行分析。检验水准α = 0.05，以P < 0.05认为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 两种组织hMLH1蛋白表达的比较

　　hMLH1蛋白在子宫内膜癌肿瘤组织的表达率为51.40%(19/37)，在正常的增生期内膜组织表达率为85.00%(17/20)。两者之间差异具有显著统计学意义(P < 0.05，图1)。

　　2.2 两种组织hMLH1基因甲基化率的比较

　　在子宫内膜癌肿瘤组织中，hMLH1基因的甲基化率为43.2%(16/37)，在正常的子宫内膜组织中的甲基化率为15.0%(3/20)。肿瘤组织中hMLH1的甲基化率明显高于正常的子宫内膜组织，两者之间差异具有显著统计学意义(P < 0.05，图2)。

　　2.3 两种组织中hMLH1的甲基化与蛋白表达的关系

　　子宫内膜癌组织中检测到的16例hMLH1甲基化阳性的组织有2例， hMLH1蛋白表达阳性(表达率12.5%)，未发生甲基化的21例中有17例表达hMLH1蛋白表达(表达率80.9%)，两者之间具有相关性(P < 0.05)。正常子宫内膜组织中检测到的3例发生甲基化的组织有1例蛋白表达(表达率为33.3%)，未发生甲基化的17例中有16例表达阳性(表达率94.1%)，两者之间具有相关性(P < 0.05)。

　　2.4 临床病理因素与hMLH1蛋白表达及DNA甲基化的关系

　　hMLH1蛋白表达与组织学分级(G1， G2， G3)有关(P < 0.05)，但与其它临床病理因素：肿瘤肌层浸润、淋巴结转移、FIGO分期和肿瘤宫颈浸润无相关性(P > 0.05)。hMLH1的甲基化与组织学分级、肿瘤肌层浸润、淋巴结转移、FIGO分期和肿瘤宫颈浸润均无相关性(P > 0.05，表1)。

　　3 讨 论

　　DNA错配修复(mismatch repair， MMR)是重要的突变避免系统，它通过校正正常DNA代谢中产生的碱基错配及调节DNA损伤所诱导的凋亡来维持基因组的稳定性[2]。它首先是在遗传性非息肉性结直肠癌综合征(hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome， HNPCC)中发现，HNPCC患者家族成员中常携带错配修复基因改变，该改变是子宫内膜癌最常见的分子缺陷机制[3

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