cal invasion with hMLH1 protein expression. hMLH1 methylation did not correlate with such clinicopathological characteristics. 【Conclusions】 hMLH1 methylation was associated with the absence of hMLH1 protein expression. The hMLH1 involved in carcinogenesis of endometrial carcinoma.
Key words： endometrial carcinoma; hMLH1 gene; expression; promoter methylation
近年来子宫内膜癌的发病率有所上升，其确切发病机理至今仍不十分清楚。随着分子生物学技术的发展和广泛应用，子宫内膜癌的分子遗传学特征已逐渐被人们所了解。目前普遍认为子宫内膜癌的发病是一个涉及多基因、多步骤的复杂过程。多个癌基因激活、抑癌基因失活的致癌模式逐渐为人们所认识。抑癌基因可通过突变和染色体缺失而失活，CpG岛甲基化也是肿瘤抑癌基因失活的途径之一。错配修复基因hMLH1是细胞内错配修复系统的重要组成部分，其功能缺失导致碱基错配不能得到有效的修复，突变累积，导致肿瘤的发生。研究发现hMLM1突变与卵巢癌、子宫内膜腺癌及胃癌均有关。同时，在多种散发性肿瘤中， hMLM1表达异常主要与启动子区CpG岛的高甲基化有关。甲基化特异性PCR克服了以往甲基化状态研究方法的局限性，即使肿瘤组织中混有正常组织也不完全影响结果，而且只需要很少量的DNA，具有简单、敏感、高效的特点。故本实验应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR)和免疫组化链霉素抗生物素-过氧化物酶染色法(S-P法)，检测子宫内膜癌及正常增生期子宫内膜组织hMLH1基因的DNA甲基化以及该基因蛋白的表达情况，旨在探讨hMLH1基因与子宫内膜癌发病机制的关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源
收集2004年3月 ～ 2006年10月在中山大学附属第一医院妇科住院手术治疗的子宫内膜癌患者37例，同期因子宫肌瘤住院行全子宫切除患者的正常的增生期子宫内膜组织20例，新鲜组织在离体后即放入液氮内保存。所取标本均经病理证实。按国际妇产科协会(Federal Institute of Gynecology and Obstetrics，FIGO) 2000年标准进行手术-病理分期，子宫内膜癌Ⅰ期20例，Ⅱ期9例，Ⅲ期6例， Ⅳ期2例。其中高分化有22例，中分化有13例，低分化有2例。患者年龄24 ～ 69岁，平均年龄49.4岁。患者术前均未行化疗、放疗、免疫、激素治疗等抗肿瘤治疗。
1.2 组织基因组DNA提取和DNA亚硫酸钠处理
组织基因组DNA提取试剂盒购自北京TIANGEN生物技术有限公司，按照试剂盒的说明提取标本的基因组。亚硫酸修饰DNA的方法[1]：1 μg DNA溶于50 μL的水中，加入NaOH(终末浓度为0.2 mol/L)， 37 ℃变性10 min，再加入10 mmol/L的氢醌30 μL(Sigma公司)和3 mol/L亚硫酸氢钠(Sigma公司，pH 5.0) 520 μL，混匀后加矿物油50 ℃孵育16 h。应用Wizard DNA纯化柱(Promega公司)纯化修饰DNA;纯化后的DNA再用NaOH(终末浓度为0.3 mol/L)于室温下处理5 min，乙醇沉淀，回收沉淀的DNA溶于30 μL的水中，-80 ℃储存备用。
1.3 甲基化和非甲基化聚合酶连反应
亚硫酸氢钠修饰的DNA进行巢式PCR，检测组织hMLH1基因是否甲基化。修饰的DNA经首轮PCR放大hMLH1基因的CpG岛，PCR引物为：5′-GGAGTGAAGGAGGTTAYGGGTAAGT-3′(forward)，5′-AAAAACRATAAAACCCTATACCTAA TC-3′(reverse)。PCR扩增片断为182 bp。
第一轮PCR产物经过50倍稀释后作为第二轮PCR反应的模板。其中甲基化聚合酶连反应(Methylation-Specific PCR， MSP)引物为：5′-ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC-3′(forward)，5′-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3′(reverse)。非甲基化PCR(Un-Methylation-Spe
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