于96孔板，24 h后分别加入终浓度为：1、5、10、25、50 μmol/L的土槿皮乙酸作用24 h，同时设置正常对照组(加实验组等体积培养液做对照)，每组6复孔，取药物作用24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，摇床混匀后，继续培养4 h，每孔吸出100 μL上清液，同时每孔加入国产DMSO 100 μL ，摇床混匀15 min，室温静置20 min后，在酶标仪(波长 = 495 nm/530 nm)测吸光度值A，计算细胞生长率：细胞生长率=(A处理组/A正常对照组)×100%。并且采用上述方法检测25.0 μmol/L 的土槿皮乙酸作用0，6，12，24 h后HeLa细胞的细胞生长率。
1.4 流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡率
将HeLa细胞按1 × 104个/mL置于100 mL 培养瓶中，分对照组和药物组，药物组为25.0 μmol/L的土槿皮乙酸，分别作用0，6，12，24 h 后用于流式细胞仪检测，每组6 复孔。细胞凋亡检测：收集对照组和药物组各2万个细胞，PBS 液洗涤，加入碘化丙啶( PI)工作液0.5 mL (浓度为10 μg/mL，北京岳泰生物公司)，室温避光30 min，FACScan流式细胞仪分析和处理数据。
1.5 Western blotting检测PI3K、Akt、bax、cyto C的表达
25.0 μmol/L土槿皮乙酸处理HeLa细胞后，按常规方法裂解细胞，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。用12%十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PA GE)分离蛋白，电转移至PVDF膜。用含50 g/L脱脂奶Tris缓冲液封闭膜上的非蛋白结合点，4 ℃过夜。分别加入1：200稀释的鼠抗人Anti-phospho-PI3K抗体、Anti-PI3K、Akt、GSK、FKHRL抗体(Cell Signaling Technologies，Beverly，MA)和Anti-Bax、bcl-2抗体(Santa Cruz Biotechnology，CA)，室温作用4 h。漂洗3 次后加第二抗体(辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体)室温作用2 h，漂洗3次。加发光剂(Lumi GLO)，置感光盒中感光，显影，定影。实验重复3次。
1.6 统计处理
数据用x ± s表示，采用统计软件SPSS 10.0 进行数据处理，组间数据采用t检验或秩和检验。
2 结 果
2.1 土槿皮乙酸诱导细胞凋亡的形态变化
在相差显微镜下，对照组细胞界限清晰，胞浆丰富，饱满;在荧光显微镜下，胞核圆形或椭圆形，染色质均匀分布，少见强荧光的胞核(处于染色体聚集的有丝分裂细胞核呈强蓝荧光)。HeLa细胞被土槿皮乙酸处理24 h后，凋亡细胞脱落悬浮于孔板底部;土槿皮乙酸终浓度5 μmol/L时，细胞变圆，体积缩小，核呈强荧光的凋亡细胞明显多于对照组;当终浓度25 μmol/L时，细胞变圆，体积缩小，表面粗糙，胞核缩小，呈强蓝色荧光，可见染色质浓缩呈斑块状，出现凋亡小体，呈典型的凋亡细胞形态(图1);当终浓度25 μmol/L时，同时加入myr-Akt处理，染色质浓缩和凋亡小体明显减少。
2.2 土槿皮乙酸抑制HeLa细胞生长
HeLa细胞经不同浓度的土槿皮乙酸处理24 h后，HeLa细胞数生长受到抑制，5 μmol/L的土槿皮乙酸时，细胞的生长率为77.4% ± 6.2%，25 μmol/L的土槿皮乙酸时，细胞的生长率为24.9% ± 4.3%，50 μmol/L的土槿皮乙酸时，细胞的生长率为18.9% ± 4.1%，结果表明25 μmol/L为体外最佳浓度，其抑制HeLa细胞生长的效应达到平台期，见图2A。与此同时，25.0 μmol/L的土槿皮乙酸作用6 h后HeLa细胞的生长受到明显抑制，12 h其抑制HeLa细胞生长的效应达到平台期(图2B)。
2.3 土槿皮乙酸诱导HeLa细胞凋亡
不同浓度的土槿皮乙酸作用HeLa细胞6、12、24 h 后， 细胞出现不同程度的亚G1峰(凋亡峰)，作用12 h后诱导HeLa 细胞凋亡明显增加(图3)。
2.4 土槿皮乙酸对PI3K、Akt、bax、cyto C表达和活性的影响
HeLa细胞经过25.0 μmol/L的土槿皮乙酸作用0、6、12、24 h后，Western blotting分析表明，见图4，Hela细胞的PI3K、Akt、bcl-2、GSK、FKHRL表达水平及活性显著降低(P < 0.05)，Bax
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