(Akt) and the expression of glycogen synthase kinase 3 (GSK3) and Forkhead like family (FKHRL). In addition， pseudolaric acid B treatment of cervical carcinoma Hela cell line down-regulated the expression of the inhibitor of apoptosis protein bax， and increase apoptosis protein bcl-2. 【Conclusion】 Our results showed that pseudolaric acid B-induced apoptosis involved several molecular pathways. Pseudolaric acid B may suppress constitutively activated targets of phosphatidylinositol-3-kinases (PI3K) and Akt in the HeLa cell line， inhibiting the proliferation and induction of apoptosis.
Key words： cervical carcinoma; pseudolaric acid B; apoptosis; Akt
[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2008，29(6)：659-663]
中药以其有效低毒的优势作为治疗肿瘤的替代疗法日益得到人们的重视，在美国草药及自然产物正被应用于肿瘤治疗的临床实验中[1-2]。土槿皮乙酸(pseudolaric acid B)是从松科植物金钱松的根皮(土槿皮)中分离出的有效成分。近年研究表明土槿皮乙酸对黑色素瘤、纤维肉瘤、乳腺癌等多种细胞株均具有明显的的体外抗肿瘤作用，对骨髓、肝、肾等低毒低。研究表明它具有抑制HeLa细胞生长的作用[3-5]，但对其抑制HeLa生长的作用机制目前尚不明。磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide-3-kinese/protein kinase B， PI3K/Akt)信号通路的发现已有十几年的历史，其在细胞代谢、细胞周期调控、血管生成等方面发挥重要作用。研究表明， PI3K/Akt通路与肿瘤的发生发展、转移、治疗耐药性密切相关，细胞在一系列内外因素的作用下，通过PI3K/Akt信号转导通路，诱导细胞的增殖、分化，避免细胞发生凋亡[6]。子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，在发展中国家尤为常见，是妇科第二大常发恶性肿瘤[7]。因此本研究将探讨土槿皮乙酸是否通过作用PI3K/ Akt信号转导通路在抑制宫颈癌HeLa细胞的生长。
1 材料与方法
1.1 细胞培养与转染
人宫颈癌Hela细胞株购自上海科学院细胞中心。HeLa细胞由含有10%新生牛血清的RPMI 1640 培养液于37 ℃、体积分数为5% CO2饱和湿度的细胞培养箱培养，实验使用细胞均为接种后24 h处于对数生长期细胞。采用Welfect-Explus试剂盒(Welgene，Deaegu，Korea)对HeLa细胞进行pECE-Myr-HA-Akt转染[8]，将HeLa细胞放入含10 μg pECE-Myr-HA-Akt DNA质粒和Welfect-Explus转染试剂的MEM培养液中于37 ℃、体积分数为5% CO2饱和湿度的细胞培养箱培养4 h，转染后再在10% FBS-RPMI培养液中继续培养24 h。
1.2 诱导细胞凋亡的形态学观察及测量
将细胞用0.25%胰蛋白酶消化，接种至24孔板中，每孔含细胞数4 × 104个，每孔0.5 mL的完全培养液中，置37℃、体积分数为5%的CO2培养24 h，更换新鲜培养基。加入土槿皮乙酸，使药物终浓度分别为1、5、10、25、50 μmol/L，继续培养48 h，加5%多聚甲醛(PBS，pH 7.2) 4 mL，固定20 min。加入Hoechst 33342，使终浓度为5 mg/L，室温暗处静置，去上清液，加PBS (pH 7.2)洗2次，在多功能倒置显微镜(Nikon TE300)下观察，并用Leica DC200拍照。
1.3 细胞生长率测定
采用MTT法检测HeLa细胞的生长率。取对数生长期细胞，用完全培养液调整细胞数为1 × 104个/mL，接种
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