粉防己碱抑制人卵巢癌HO 8910细胞生长的研究

　　1.3 实验指标的检测

　　1.3.1 MTT试验

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×105个/mL的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔200μL，过夜贴壁后;实验组加入1.0mg/L, 5.0 mg/L，10.0 mg/L及20.0 mg/L的粉防己碱，对照组加等量的RPMI-1640。每组设6个复孔，继续培养24、48h后加入MTT(5mg/mL) 20μL/孔，4h后吸净上清液，加入DMSO 20μL/孔，震荡10min，用酶标记光仪在波长为560nm时测定每孔的吸光度(A)值，计算不同浓度抗体对细胞增殖的抑制率[抑制率=(对照组A均值-实验组的A均值) /对照组A均值 [1]]。

　　1.3.2 AO染色

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为5×105个/mL的单细胞悬液，按上述粉防己碱浓度培养48h后，离心弃上清，用PBS洗3次，95%乙醇固定15～30min;1%醋酸酸化30s;加入0.01%AO染色1～5min，封片，镜下观察并摄影。

　　1.3.3 流式细胞仪检测细胞周期

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液，按上述浓度培养24h后，收集细胞，PBS洗涤，制成单细胞悬液，用70%的冰乙醇4℃固定12h，用含核糖核酸酶及碘化丙锭的染液染30min，上流式细胞仪进行检测。

　　1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液，接种于6孔培养板中，按上述浓度培养24h后，收集细胞，用AnnexinV-FITC/PI双标记染色后做流式细胞仪双色分析。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，所有数据均用±s表示，统计方法采用方差分析，组间比较采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 MTT试验结果

　　实验结果显示：粉防己碱对HO-8910细胞的生长具有明显的抑制作用, 实验范围内最大抑制率达61.35%，且抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强，呈现剂量、时间依赖性作用, 经统计学检验差异具有显著性意义(P< 0.01，见表1)。

　　表1 实验组和对照组卵巢癌细胞内的吸光度值和增殖抑制率(±s)组别粉防己碱

　　(mg/L)24h吸光度值(±s)抑制率(%)48h吸光度值(±s)抑制率(%)对照组00.605±0.00600.608±0.0050实验组10.562±0.004*△7.110.535±0.003*△12.0150.508±0.009*△16.030.420±0.005*△30.92100.450±0.008*△25.620.325±0.003*△46.55200.333±0.008*△44.960.235±0.003*△61.35

　　注：同一作用时间采用方差分析及q检验*P<0.01;同一浓度组采用t检验△P<0.05

　　2.2 AO染色

　　凋亡细胞体积明显缩小，核碎裂，核内可见浓缩边集的染色质，呈新月形或肾形致密浓染的黄绿色染色，荧光亢进 (图1)。

　　2.3 粉防己碱对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响

　　不同浓度粉防己碱作用卵巢癌细胞24h后，与对照组相比，细胞周期分布、凋亡率均发生改变，即G1/G0期细胞比例数上升，S期和G2/M期下降，细胞凋亡率上升，均有显著差异(P<0.05)，且与粉防己碱浓度之间具有剂量依赖性(P<0.05，见表2)。

　　表2 粉防己碱对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响(±s)注：采用方差分析*P<0.01

　　3 讨 论

　　粉防己碱是一种具有广泛药理学作用的双苄基异喹啉类生物碱，是粉防己的主要有效成分。早期研究表明粉防己碱具有消炎、镇痛、降压、抗纤维化等广泛的药理作用。近年来的研究证实粉防己碱是天然的非选择性的钙通道阻滞剂，又是钙调蛋白的拮抗剂，具有直接抗肿瘤的作用。Kuo等[2]发现，粉防己碱不仅抑制人肝癌Hep G2细胞株的生长，还可诱发凋亡。何琪扬[3]等采用台盼蓝计数法发现粉防己碱对敏感急性白血病细胞株HL260和抗三尖杉酯碱的HL-60细胞均有生长抑制作用。王

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