dium in the study group were (0.16 ± 0.08) ?滋g/L and (3.6 ± 2.0) μg/L， respectively， significantly lower than those in the control group [(0.41 ± 0.16) μg/L and (6 ± 4) μg/L respectively]， P < 0.05.【Conculsion】 Our data suggested that BMP-4 could promote the transition of primordial-preantral follicle， decreased cell apoptosis， inhibited the progesterone production and promoted cell survival in vitro. It may be a promoting factor of human follicle development during in vitro culture.
Key words： ovarian tissue; in vitro culture; primordial follicle; bone morphogenetic protein-4; follicle development
[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2008，29(6)：676-679]
哺乳动物始基卵泡体外生长和成熟的能力在1996年由Eppig和O′Brien首先证实[1]，目前虽在卵泡体外培养途径和培养体系等方面取得了一定进展，并进行了冷冻-解冻后人卵巢组织体外培养的初步研究[2]，但关于始基卵泡生长启动的探索还处于起步阶段。已有动物试验证实骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic protein-4，BMP-4)在体外能促进始基卵泡生长，抑制卵泡凋亡[3]，但尚未见其对人卵泡作用的相关报道。本研究通过向培养液中加入BMP-4观察其对人始基卵泡体外存活和生长发育的影响，探讨其在始基卵泡生长启动中所起的作用。
1 材料与方法
1.1 病例资料
选取中山大学附属第二医院妇产科2005年5月至11月间进行卵巢手术(包括巧克力囊肿16例、畸胎瘤10例、子宫肌瘤6例和宫颈癌2例)的34例患者作为研究对象，年龄14 ～ 38岁，平均30(S = 5岁)，有规律月经、无内分泌紊乱、无放化疗史、半年内无激素服用史，卵巢囊肿直径 < 7 cm。该实验得到中山大学附属第二医院生殖医学伦理委员会的批准，并与患者签署知情同意书。
1.2 实验方法
①将在开腹或腹腔镜下获得的卵巢组织标本立即置于室温保存的HEPES-MEM培养液(Gibco公司)中，冲洗两次后在解剖显微镜下将卵巢组织切成2 mm × 2 mm × 1 mm的皮质片，每一例患者的卵巢皮质片均随机分为三组：研究组(即BMP-4组)、对照组和非培养组，非培养组是将卵巢皮质片直接放入40 g/L甲醛中固定，前两组行体外培养;②卵巢组织体外培养 预先在24孔培养板的培养孔内放入盖有微孔滤膜的不锈钢筛网支架(10 mm × 10 mm × 3 mm)，将2 ～ 4块卵巢皮质片放置到滤膜上，分为两组在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养15 d，每隔两天更换400 μL培养液，并将更换过的培养液收集到试管中于 -20 ℃保存：
对照组：用基本培养液进行培养。基本培养液为：α-MEM(Gibco公司) + 5 g/L人白蛋白(德国贝林) + 1% ITS(胰岛素10 μg/mL，转铁蛋白5.5 μg/mL，亚硒酸钠6.7 ng/mL，Gibco公司) + 抗生素(青霉素50 U/mL，硫酸链霉素50 μg/mL)。研究组：向基本培养液中添加重组人BMP-4(R&D System，Inc.)100 ng/mL。
1.3 组织学检查
培养结束后3组卵巢组织标本行组织学检查，切片厚度5 μm，HE染色后在光镜下阅片，每个标本观察10个高倍镜视野( × 400)，计数各级卵泡数量并计算所占比例，卵泡计数以卵母细胞核作为标记，根据卵泡形态标准评估卵泡发育阶段[4]：①始基卵泡：由一个初级卵母细胞及环绕其周围呈单层梭形的前颗粒细胞组成;②窦前卵泡：增大的初级卵母细胞周围包绕单层柱状颗粒细胞即为初级卵泡;增大的初级卵母细胞周围有多层立方状颗粒细胞，即为次级卵泡;③窦状卵泡：颗
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