子宫内膜癌中VEGF

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 48例子宫内膜癌组织和36例正常子宫内膜组织均来自2003年1月-2004年12月我院妇科手术切除标本，均经病理证实。患者年龄32~71岁，中位年龄52.2岁。按FIGO标准分期，Ⅰb2期15例，Ⅱa期20例，Ⅱb期13例; 按WHO组织学类型分型：腺癌12例，鳞癌32例，腺鳞癌4例;病理分化程度：高分化6例，中分化22例，低分化20例。术后证实无淋巴结转移19例，淋巴结转移29例。肿瘤直径<4 cm 28例，肿瘤直径≥4 cm 20例。癌组织局限于浅肌层以内27例，有深肌层浸润者21例。所有病例术前均未经任何治疗，临床资料完整。

　　1.2 标本采集 手术切除的子宫内膜癌标本离体后，立即于无菌状态下沿肿瘤边缘切取生长活跃的瘤组织，将所取组织切成3~5 mm的组织小碎块装入冻存管内并立即放入液氮中，随后将其转入-70℃冰箱内保存。采用同样的方法切取和保存作为对照的正常子宫内膜组织，对照标本均取自子宫肌瘤行全子宫切除的患者。

　　1.3 方法

　　1.3.1 RNA的提取及检测：总RNA提取用TRIzol试剂一步法。

　　1.3.2 多重RTPCR：所用的引物和内参照β2微球蛋白(β2MG)引物均委托上海生工公司合成，VEGFC、KDR所用引物序列参照了以前研究者的设计[2] 。根据VEGFC及KDR引物Tm值，DNAstar软件设计了Flt4的引物序列(见表1)。表1 引物序列引物序列Tm值片段 163根据QIAGEN OneStep RTPCR Kit的说明，在同一反应体系中同时扩增β2MG、VEGFC、KDR及Flt4的4对引物，为去除多重PCR反应中的扩增竞争，较为准确地获得不同靶基因的扩增结果，体系中使用QIAGEN OneStep RTPCR Kit试剂盒提供的Q溶液。根据紫外分光光度仪检测的OD值计算RNA样品浓度，将RNA样品稀释，以保证RTPCR体系中RNA模板加样4 μl时，所加的模板含量基本一致，即首先做到模板定量。具体PCR循环参数为：变性94℃ 60 s，退火52℃ 60 s，延伸72℃ 90 s，共35个循环。最后延伸72℃ 10 min以获得更多的扩增产物。

　　1.3.3 扩增产物半定量分析：PCR反应扩增产物4 μl加4 μl载样缓冲液加15 μl溴酚兰，以05×TBE为电泳缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上80 V恒压电泳40 min。将电泳结果用凝胶成像仪扫描记录并借助凝胶图像分析系统(BioCapT V.10)测定灰度。以VEGFC、 KDR、flt4和βactin条带灰度值之比作为相对光密度。

　　13.4 统计学处理：用SSPS统计软件(11.0版本)进行，所用的统计学方法为卡方检验，P<005认为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 VEGFC及其受体mRNA在肿瘤组织(T)及正常子宫内膜组织(N)中的表达 VEGFC阳性者可见320 bp条带，flt4阳性者可见402 bp条带， KDR阳性者可见555 bp条带 (见图1)。各项指标在肿瘤组织中的表达率均明显高于正常子宫内膜组织，其具体表达率见表2。图1 子宫内膜癌组织中VEGFC及其受体KDR、Flt4 mRNA的表达。表2 VEGFC 及其受体mRNA在不同组织中的表达

　　2.2 肿瘤组织(T)中VEGFC及其受体mRNA表达的相关性(见表3) 在肿瘤组织中VEGFC mRNA表达与Flt4 mRNA的表达有显著的相关性，但与KDR mRNA的表达无明显的相关性。表3 肿瘤组织中VEGFC及其受体mRNA表达的相关性受体统计结果显示，肿瘤组织中VEGFC mRNA及其受体mRNA表达与肿瘤的病理类型及临床分期无明显的相关性;而与肿瘤的病理分化程度、淋巴结转移、肿瘤直径、深肌层浸润有明显的相关性(P<005)。

　　3 讨论

　　子宫内膜癌的临床特点是局部蔓延，肿瘤细胞主要通过淋巴途径转移，沿着组织间隙直接向子宫内膜或宫体以外扩展，临床多以有无淋巴结转移来评估预后及指导治疗，因而早期预测和发现有无淋巴结转移具有重要临床意义。近来研究发现血管内皮生长因子C(vascular endot

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