慢速冷冻和玻璃化冷冻对人类卵巢组织中卵泡形态的影响

　　1.4 电镜检查

　　A、B、C、D 4组中每组各选2个卵巢组织片固定在25 g/L戊二醛中，经包埋修块后行半薄切片，甲苯胺蓝染色后在光镜下定位组织学形态正常的原始卵泡，超薄切片后经醋酸铀及硝酸铅双重染色后在透视电镜下观察超微结构。

　　1.5 统计学处理方法

　　数据用SPSS10.0统计软件处理，结果用均数±标准差表示，各组中形态正常的卵泡比例采用One-Way ANOVA分析，各组之间两两比较用LSD方法，P< 0.05认为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 组织学检查

　　A组共观察到原始卵泡196个，形态正常的原始卵泡比例为72.5%±8.4%，初级卵泡41个，形态正常的初级卵泡比例为62.0%±13.9%;B组共观察到原始卵泡233个，形态正常的原始卵泡比例为65.6%±12.8%，初级卵泡48个，形态正常的初级卵泡比例为58.1%±7.9%;C组共观察到原始卵泡286个，形态正常的原始卵泡比例为66.1%±11.1%，初级卵泡43个，形态正常的初级卵泡比例为59.0%±16.2%;D组共观察到原始卵泡232个，形态正常的原始卵泡比例为48.4%±13.3%，初级卵泡58个，形态正常的初级卵泡比例为37.0%±14.0%。D组形态正常的原始卵泡比例明显低于A、B、C组(t=4.12，P < 0.01);A、B、C 3组中形态正常的原始卵泡比例无明显差异(t=1.32，P >0.05)。D组中形态正常的初级卵泡比例低于A、B、C组(t=2.48，P < 0.05);A、B、C 3组中形态正常的初级卵泡比例无明显差异(t=1.69，P >0.05;图1.A-D)。

　　2.2 电镜检查

　　相对于A组中形态正常的原始卵泡超微结构，B、C组中组织学形态正常的原始卵泡超微结构无明显改变，仅见卵母细胞和前颗粒细胞的细胞浆基质电子密度稍下降，个别线粒体肿胀。D组中组织学形态正常的原始卵泡超微结构存在一定程度的改变，主要见前颗粒细胞和卵母细胞的胞浆基质电子密度下降，部分线粒体和内质网肿胀，粗面内质网表面核蛋白体稀疏，卵母细胞浆内小空泡稍增多，个别前颗粒细胞膜可见微小的缺损，前颗粒细胞和卵母细胞间的微绒毛分布相对稀疏(图2.A-D)。

　　3 讨 论

　　3.1 慢速冷冻和玻璃化冷冻对卵泡组织学形态的影响

　　张佳荣等[3]报道慢速冷冻和玻璃化冷冻对小鼠卵巢组织中原始卵泡形态的影响无明显差异。但是本实验中发现慢速冷冻对人类卵巢组织中原始卵泡和初级卵泡的形态影响较大，而玻璃化冷冻对原始卵泡和初级卵泡的形态影响与新鲜卵巢组织相比无明显差异。Gandolfi等[4]报道玻璃化冷冻人类卵巢组织可以较好的保存原始卵泡和初级卵泡，Gook等[5]报道慢速冷冻人类卵巢组织对原始卵泡和初级卵泡的形态影响较大，与本实验结果一致，提示玻璃化冷冻是人类卵巢组织较适宜的冷冻保存方法，相对优于慢速冷冻。可能是因为卵巢组织中含有多种类型细胞，对缓慢降温的速度、人工植冰时机等要求各不相同而且差异较大，使得慢速冷冻卵巢组织后较易形成冰晶，冷冻损伤较大。而玻璃化冷冻始终保持组织细胞溶液中水分子和离子的原始分布，减少甚至避免冰晶的形成，避免不同类型细胞所需的不同的冷冻平衡要求，使得卵巢组织中原始卵泡和初级卵泡均得到有效保存。

　　3.2 慢速冷冻和玻璃化冷冻对原始卵泡超微结构的影响

　　本实验中发现玻璃化冷冻后组织学形态正常的原始卵泡超微结构无明显改变。有学者报道小鼠卵巢组织玻璃化冷冻后原始卵泡的超微结构无明显改变[6]，与本实验结果相一致。提示玻璃化冷冻后组织学形态正常的原始卵泡超微结构无明显损伤。Oktay等[7]报道慢速冷冻保存人卵巢组织，组织学形态正常的原始卵泡超微结构无明显损伤。但是本实验发现慢速冷冻后组织学形态正常的原始卵泡超微结构中可见线粒体、内质网肿胀，粗面内质网脱颗粒，微绒毛减少，卵母细胞浆内小空泡增多以及个别的前颗粒细胞膜不完整，提示慢速冷冻后组织学形态正常的原始卵泡超微结构存在一定的损伤，但是对原始卵泡的发育潜能是否存在影响尚需进一步研究。

　　3.3 不同的

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