慢速冷冻和玻璃化冷冻对人类卵巢组织中卵泡形态的影响

　　Key words: ovarian tissue; slow freezing; vitrification; follicle

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(1):70-74] 随着医学诊疗技术的飞速发展，恶性肿瘤患者的生存率得到明显提高，但是抗癌治疗对卵巢功能存在一定程度的损伤，出现月经稀发、闭经、不孕和卵巢功能早衰等，对患者的生存质量和生育能力造成严重影响。因此，如何保存患者的卵巢功能成为迫切需要解决的问题。卵巢组织冷冻保存是一种较理想的卵巢功能保存方法。目前常用的冷冻方法是慢速冷冻。但是慢速冷冻难以完全避免冰晶形成，而且需要借助精密控温仪器，操作较复杂，从而影响慢速冷冻在卵巢组织冷冻保存中的推广应用。玻璃化冷冻，是近年来出现的一种新的冷冻方法，操作简便，无需精密仪器控温[1,2]。玻璃化冷冻的关键是使组织细胞较好的形成“玻璃化”态，尽量减少冰晶的形成。目前主要是通过改良冷冻载物加快冷冻降温速度来改善玻璃化冷冻效果。本研究比较慢速冷冻、尼龙网玻璃化冷冻和麦管玻璃化冷冻对人类卵巢组织中卵泡形态的影响，探讨人类卵巢组织适宜的冷冻保存方法，为冻融卵巢组织在移植、体外培养等研究奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　选取中山大学附属第二医院妇产科2004年6月至2005年2月间进行卵巢手术的患者16例为研究对象，年龄27～35(30.2±2.5)岁，有规律月经、无内分泌紊乱、无放化疗史且半年内无激素服用史。卵巢组织冷冻保存通过医院生殖医学伦理委员会批准，与患者签署知情同意书。

　　1.2 实验方法

　　①在开腹或腹腔镜手术中活检外观正常的卵巢组织，在室温保存的磷酸盐缓冲液中迅速运送至实验室。将卵巢皮质剪成约5 mm×2 mm×1 mm的组织片，随机分配到新鲜卵巢组(A组)、麦管玻璃化冷冻组(B组)、尼龙网玻璃化冷冻组(C组)和慢速冷冻组(D组)。②B组：卵巢组织片浸泡在快速冷冻液中(含有5.5 mol/L乙二醇、1.0 mol/L 蔗糖、100 mL/L胎牛血清的磷酸盐缓冲液)，在室温下平衡10 min用麦管(0.25 mL)按3段式法装管，炭粉封口后直接投入液氮中。保存48 h后采用3步法依次在含有1.0 mol/L蔗糖和100 mL/L胎牛血清的磷酸盐缓冲液、0.5 mol/L蔗糖和50 mL/L胎牛血清的磷酸盐缓冲液、0.25 mol/L蔗糖和25 mL/L胎牛血清的磷酸盐缓冲液中逐步稀释去除冷冻保护剂，每次平衡时间5 min，最后在磷酸盐缓冲液中冲洗2次。③C组：卵巢组织片在快速冷冻液中室温下平衡10 min，将卵巢组织片平铺放入尼龙网袋(长2 cm、宽2 cm、网孔直径80 μm)，将尼龙网袋直接投入液氮中。保存48 h后进行快速复温，复温方法同B组。④D组：卵巢组织片浸泡在慢速冷冻液中(含有1.5 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸盐缓冲液)，在0 ℃平衡30 min，装管方法同B组，采用Oktay[3]的慢速冷冻方法保存。将麦管放入程序冷冻仪内，从0 ℃开始以2 ℃/min的速度降温至-7 ℃，平衡10 min后进行人工植冰，再以0.3 ℃/min的速度缓慢降温至-40 ℃，后以10 ℃/min的速度降温至-140 ℃，最后将麦管投入液氮中，保存48 h后进行快速复温，以冷冻保护剂的浓度梯度逐步置换冷冻保护剂(含有1.0 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸盐缓冲液，含有0.5 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸盐缓冲液，含有0.25 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸盐缓冲液)，每次平衡时间5 min，最后在磷酸盐缓冲液中冲洗2次。

　　1.3 组织学检查

　　石蜡包埋卵巢组织，以5 μm的厚度连续切片，间隔50 μm的厚度行HE染色在光镜下阅片。单盲法观察原始卵泡和初级卵泡的形态。按Gougeon[

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