Eag1钾离子通道在宫颈癌中的表达以及缺氧对其的调控

　　[Key words] cervical cancer; potassium channels; Eag1

　　宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，虽然目前诊疗技术有了较大的提高，但仍有30%～40%的患者死于局部复发和远处转移。

　　研究表明组织缺氧是导致肿瘤发生、发展，最终产生放、化疗抵抗的主要原因之一。最近有关离子通道与低氧适应之间的关系引起了越来越多的注意[1]。目前认为离子通道中最常与细胞增殖和肿瘤相关的是钾通道;其中膜Eag1钾离子通道被认为与宫颈癌的相关性最为密切[2]。本研究以不同病变宫颈组织为研究对象，通过免疫组化方法研究Eag1钾离子通道在宫颈癌发生、发展过程中的表达情况;以体外培养的人宫颈癌Hela细胞为研究对象，观察缺氧对Eag1钾离子通道表达及电生理活性的影响，以期为宫颈癌的诊治提供新的途径。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 标本全部来自第三军医大学第三附属医院妇产科1995年12月-2008年12月诊治的病例，全部标本均经我院病理科诊断并证实，患者年龄24～77岁，平均46岁。

　　1.2 细胞准备

　　1.2.1 细胞培养 Hela细胞为本室培养的细胞株。使用含10%小牛血清的DMEM培养基，置于5%CO2、95%空气、37℃、饱和湿度的孵箱内培养。

　　1.2.2 缺氧模型 观察细胞70%～90%融合，在无菌条件下弃去大部分培养液。将混合气体(含90%N2、5%CO2、5%O2)以10L/min流量充入密闭容器，持续20min，同时关闭进气口和出气口，抽取气体经血气分析仪检测容器内O2浓度小于5%。

　　1.3 Eag1表达的检测

　　1.3.1 免疫组化检测方法 兔抗人Eag1单克隆抗体购自sigma公司。组织标本常规石蜡包埋，制成4μm厚切片，常规脱蜡，30%新鲜双氧水灭活内源酶，将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉加热至沸后断电,间隔10min重复两次,冷却后0.02M PBS洗涤,抗原修复液修复抗原,山羊血清封闭后不洗,滴加1:150稀释的Eag1单克隆抗体,4℃过夜,0.02M PBS洗后加生物素标记羊抗兔二抗,30℃染色20min后,DAB显色,苏木素轻度复染,二甲苯透明,封片。显微镜下观察并计数阳性染色细胞数。

　　1.3.2 判断标准 Eag1主要定位于胞浆和(或)胞膜。根据肿瘤细胞显色的比例及染色强度，对Eag1表达做半定量评定[3]。按阳性细胞率评分：阳性细胞数占<11%为1分; 11%～50%为2分; 51%～80%为3分;>80%为4分。按显色程度评分:染色弱为1分;中等染色为2分;强染色为3分。然后将两种评分结合起来分为4级:无论染色强度如何,细胞阳性率≤10%为阴性;评2或3分者为弱阳性(+);评4或5分为中度阳性(++);6或7分为强阳性(+++)。若1例标本有2个染色结果,则取1个纳入统计。

　　1.4 RT-PCR法检测低氧对Eag1 mRNA表达的影响 Trizon试剂盒购自Invitrogen 公司，反转录试剂盒购自TaKaRa公司。Eag1引物为：5 -TAATGGCTTCCCTCTTTCATCTCCT-3 ;5 -TGTTGAGACTCCTCCATTCCTTCCA-3 (450 bp);β-actin引物为：5 -CACGGCTGCTTCCAGCTCCT- 3 ;5 -CTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3 (150 bp)。取(0.5～1)×107细胞，按Tripil试剂盒说明提取总RNA，按反转录试剂盒说明进行逆转录反应，Eag1 mRNA的PCR反应条件为94℃变性30s，58℃Eag1退火30s，72℃ 2min，最后72℃延伸2min。琼脂糖电泳测定Eag1 mRNA表达，拍照。每组检测6瓶细胞。

　　1.5 全细胞膜片钳法检测Hela细胞缺氧后钾离子通道改变 应用电极拉制器用两步法拉制玻璃毛细管电极。应用Axon公司的pClamp软件中的Clampex采集数据，采样频率为10kHz，滤波频率为1～5kHz。PClamp软件输出刺激命令给膜片钳放大器，通过探头、记录电极施加到细胞内，用于钳制细胞膜电位和诱发钾离子通道电流。

　　1.6 统计学处理 应用SPS

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