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离体异位子宫内膜细胞中单核细胞趋化蛋白 |
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chemoattractant protein-1 Interleukin-1Tumor necrosis factor
子宫内膜异位症（内异症）为妇产科最常见的疾病之一，该病发展的病理生理过程较为复杂。有学者认为，内异症患者腹腔液中巨噬细胞的含量及活性显著增加与该病的发生、发展密切相关［1，2］，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）对单核细胞具有特异的趋化活性，可能是腹腔液巨噬细胞增加的加强因素［3］。因内异症患者腹腔液中的白细胞介素-1β（IL-1β）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平明显增高［4］，我们采用体外培养的方法，观察这两种细胞因子对盆腔的异位内膜细胞产生MCP-1的影响，探讨异位病灶在内异症发生、发展中的作用。
资料及方法
一、资料来源
收集1997年4月至1997年11月间，因内异症而在同济医科大学附属同济医院妇产科行手术治疗的15例患者的典型异位病灶组织（卵巢、盆腔腹膜及腹壁异位灶）。标本取出后立即置入4℃无菌、含青霉素及链霉素的平衡溶液(Hank溶液)中送入实验室。患者年龄26～42岁，手术均在月经中晚期进行，所有患者近3个月内未接受任何药物治疗。所取组织均经病理学检查证实。
二、方法
1．组织处理及细胞培养：将所取的新鲜组织尽量剪碎，加入0.1％胶原酶溶液混匀后于37℃、5%二氧化碳培养箱中放置120～150分钟。在消化后的细胞悬液(含有内膜腺细胞及间质细胞)中加入培养液，置入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，培养液的配制为改良eagle培养基(MEM, 美国Gibco公司产品)中，加入10%小牛血清、2%谷氨酰胺、20 mmol缓冲盐(Hepes)、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素。24小时后倒去未贴壁细胞继续培养。
2.分组：待细胞全部融合或大部分融合(约5～6天)，用胰蛋白酶消化后将细胞平均分种于24孔板及放有小玻片的培养瓶中，待细胞长满(约3天，每孔细胞数为1×105个)后，将细胞分为3组：(1)对照组：单用培养液培养；(2)IL-1β诱导组：于培养液中加入终浓度为2ng/ml的IL-1β(美国Gibco公司产品)；(3)TNF-α诱导组：于培养液中加入TNF-α(美国Gibco公司产品)，终浓度为20mg/ml。各组细胞孵育4小时（本实验证实，IL-1β及TNF-α刺激4小时后内膜细胞MCP-1的分泌活性即可达高峰）后，分别收集各组细胞和细胞爬片。
3．MCP-1的测定：(1) 培养细胞中MCP-1 mRNA的测定：采用斑点杂交分析方法。收集24孔板的细胞采用总RNA按一步提取法(Trizol试剂，美国Gibco公司产品)提取总RNA。各组取20 μg RNA点于硝酸纤维素微孔滤膜上。用于杂交的MCP-1探针（西安医科大学免疫病理室合成），是由35个碱基组成的寡核苷酸，与MCP-1 cDNA序列的第257～292个核苷酸互补。探针的5′末端按DNA标记试剂盒(德国Promeaga公司产品)的步骤进行γ-磷32（北京福瑞公司）标记。经预杂交、杂交、曝光后，应用全自动图象分析仪对每一斑点的积分吸光度双盲法进行检测，MCP-1 mRNA表达水平与积分吸光度值呈正相关。(2) 培养细胞中MCP-1蛋白的测定：收集异位细胞爬片，采用免疫组织化学链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(SABC法，试剂盒购自武汉博士德生物工程公司)染色，用兔抗MCP-1抗血清检测细胞内MCP-1含量，经显色、脱水、透明，中性树胶封固后，全自动图像分析仪测定细胞内显色颗粒的平均吸光度值。(3) 细胞培养上清中MCP-1含量的测定：采用夹心酶联免疫吸附试验法（ELISA法，试剂购自美国Gibco公司）。对照组、IL-1β诱导组及TNF-α诱导组细胞培养4小时后，更换单纯培养液（每孔1 ml）继续孵育24小时后收集上清。兔抗人MCP-1多克隆抗体(军事医学科学院产品)及人类MCP-1 抗原用于检测各组异位内膜细胞培养上清中MCP-1的含量，用酶标分析仪测量波长490 nm处的光吸收率，从MCP-1的标准曲线确定培养上清中MCP-1的含量。在倒置显微镜下观察3组细胞的形态变化。
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