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重组B7 |
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ll lines. Conclusion B7-1 transfected K 562 and HL-60 cell lines could induce the proliferation and differentiation of the T cells. It is likely that B7-1 transfected cells may be capable of inducing the activity of cytotoxic T lymphocyte, and that B7-1 transgene therapy is possible for the treatment of leukemia in childhood.
【Key words】 Retroviridoe Leukemia T-lymphocytes Antigent, CD80
B7-1(CD80)是存在于抗原提呈细胞(APC)膜上的糖蛋白分子，与T细胞表面的CD28结合能协同细胞免疫反应、促进T细胞增殖、产生白细胞介素α(IL-2)等淋巴因子。自B7分子首次被报道以来，转B7基因治疗恶性肿瘤一直为肿瘤免疫的研究热点之一。为研究转B7基因治疗白血病的可行性，本研究构建了重组B7-1逆转录病毒载体，并就B7-1基因对T细胞增殖和细胞因子表达的影响进行了初步研究。
材料和方法
一、试剂和细胞株
Oligo(dT)15。MLv-RT，dNTP，Taq酶及各种限制性内切酶均为Gibco公司产品。丝裂霉素c购自Promega公司，鼠抗人CD 80(anti-B7-1)购自美国Ancell公司，FITC-羊抗鼠免疫球蛋白购自成都华美公司，白血病细胞株K 562及HL-60由重庆医科大学汤为学教授赠送，NIH3T3细胞及EB病毒株B958购自重庆医科大学病理生理教研室，PA 317细胞由第三军医大学分子生物学教研室刘昕博士赠送。EBV转化的B淋巴细胞株由我室制备。
二、构建重组B7-1逆转录病毒载体
1.B7-1cDNA的克隆：从EBV转化的B淋巴细胞中提取总RNA，经逆转录酶合成cDNA，根据基因库报道的B7-1序列设计两对引物［1］。用巢式聚合酶链反应技术(PCR)方法合成B7-1cDNA。
2.克隆B7-1基因到逆转录病毒载体：用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切B7-1基因及逆转录病毒载体由Miller(USA)赠送，T4连结酶连结并转染人大肠杆菌Mc1061，筛选阳性菌落，PCR和酶切鉴定B7-1阳性克隆。用碱裂变法扩增纯化质粒PLB7SN。
3.B7-1基因测序：采用双脱氧测序法，全自动测序仪ABI Prism 377测序。
4.病毒包装及滴度检测：用磷酸钙沉淀法［2］转染PLB7SN和对照逆转录病毒载体人包装细胞PA 317，G 418筛选阳性克隆。病毒上清感染NTH 3T3细胞，G 418筛选，8天后计数克隆数，所获重组病毒滴度为2×105 CFU/ml。
5.感染肿瘤细胞：用重组B7-1病毒上清2 ml感染HL-60和K 562，同时以空载体LXSN作对照，G 418筛选阳性克隆，获抗G 418的阳性克隆株B7-1+ HL-60，neo-HL-60(转空载体细胞)，B7-1+ K562和neo-k 562，RT-PCR方法检测B7-1 mRNA表达，流式细胞仪(FACS)检测B7-1蛋白表达［3］。
三、转B7-1基因肿瘤细胞对T细胞功能的影响
1.以淋巴细胞分离液从正常肝素抗凝血分离外周血单个核细胞(PBMC)，用丝裂霉素C(40 μg/L×106 37℃,1小时)［4］处理的肿瘤细胞［B7+K 562，载体修饰(neo)-K 562，野生型(wild)-K 562，野生型细胞)］及B7+HL-60,neo-HL-60，wild-HL-60)作为刺激细胞，加PBMC(1×105/孔)于55孔培养板，分别加入各种刺激细胞(1×104/孔)，37℃，5%CO2培养5天，加3HTdR(1 μci/孔)后继续培养16小时，收集细胞测定HTdR掺入值。
2.取1×106PBMC(1 ml)于24孔板，分别加入丝裂霉素c处理的肿瘤细胞1×105/孔(100 μl)，混匀后置37℃、5%CO2培养，培养后12、24、48小时收集细胞提取总RNA，用RT-PCR测IL-2和IFN-&上一页 [1] [2] [3] 下一页
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