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线粒体tRNAleu UUR 基因突变和细胞色素C氧化酶活性降低在妊高征发病中的作用 |
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e Polymerase chain reaction
妊高征的确切病因尚未彻底阐明，但其发病具有家族倾向性。随着研究的深入，从分子基因水平探讨遗传因素在妊高征发病中的作用，已成为阐明妊高征发病原因的重要环节之一，近年来引起了许多学者的关注。人类线粒体基因属核外遗传物质，编码氧化磷酸化反应所需的酶复合物的13个亚单位和22个转运核糖核酸以及2个核糖体核糖核酸，它们都是线粒体蛋白合成所必须的。线粒体呼吸功能和氧化磷酸化系统功能的维持，需要整个线粒体基因组的表达。线粒体基因较核内基因容易突变，并难以修复。线粒体DNA中极少有内含子，基因组中任何突变几乎都可以影响其编码功能，引起线粒体功能障碍。细胞色素C氧化酶是线粒体内膜呼吸链的末端复合物，其改变亦可影响线粒体的功能。有报道，在妊高征高发病率家族中存在着线粒体tRNAleu(UUR)基因的点突变［1，2］。本研究旨在通过检测妊高征患者胎盘细胞色素C氧化酶活性及线粒体tRNAleu(UUR)基因3243位点A→G突变，探讨线粒体基因突变及能量代谢障碍在妊高征发病中的作用。
资料与方法
一、研究对象
研究对象为1997年11月～1998年5月在我院妇产科住院分娩的晚期妊娠妇女，共117例。分成两组：妊高征组（57例）均为中度和重度妊高征患者［3］，其平均年龄(27.0±3.3)岁，平均孕周(37.4±3.2)周；对照组（60例）为正常妊娠妇女，其平均年龄(27.1±3.1)岁，平均孕周(39.3±1.2)周。两组孕妇均无心、肝、肾脏疾病、糖尿病及神经肌细胞疾病病史。
二、研究方法
1.线粒体tRNAleu(UUR)基因3243位点突变检测： (1) DNA提取：抽取两组孕妇外周血2～3ml，用十二烷基磺酸钠、蛋白酶K消化，酚、氯仿和异戊醇提取总DNA。 (2) PCR-酶解分析： 引物序列［4］为nt3130-3149（5′-AGGACAAGAGAAATAAGGCC-3′）和nt3404-3423（5′-CACGTTGGGGCCTTTGCGTA-3′），在20 μl的反应体系中进行聚合酶链反应(PCR)扩增，循环条件为：96℃变性2分钟，然后，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，70℃延伸1.5分钟，共10个循环。再90℃变性1分钟，60℃退火1分钟，70℃延伸1.5分钟共20个循环，最后60℃延伸30分钟。PCR产物以6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。取2 μl PCR产物，37℃在20 μl反应体系中用限制性核酸内切酶 ApaⅠ 5U酶解4小时，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。(3) 阳性对照标本：1例证实有nt3243A→G突变的患者的DNA作为ApaⅠ酶切的阳性对照。
2.细胞色素C氧化酶活性的测定:产后立即留取妊高征组患者32例和对照组孕妇26例的胎盘组织,分离胎盘绒毛,放入液氮中保存。所有标本同批测定，测定时称取胎盘组织100mg，匀浆，然后取0.18mmol/L细胞色素C 0.5ml,加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)和Na2S2O4摇匀，用UV-754紫外可见分光光度计在550nm波长下测得A值，然后加入胎盘匀浆液0.1ml，立即开始计时，随后每隔1分钟测定1次A值，持续测定5分钟，最后加入饱和高铁氰化钾溶液1滴，使之完全氧化并记录结果。以最小二乘法计算，并经原点线求其斜率（K）值［5］，即为细胞色素C氧化速率常数，代表细胞色素C氧化酶的活力。
三、统计学方法
检测结果以均数±标准差表示，显著性检验采用t检验。
结果
一、两组孕妇细胞色素C氧化酶活性比较
妊高征组胎盘组织5分钟细胞色素C的氧化速率为(0.30±0.39)/分，明显低于对照组的（0.73±0.54)/分，差异有极显著性（P<0.01）。
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