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褪黑素对大鼠肠缺血 再灌注损伤保护作用的实验研究 |
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itric oxide
肠缺血/再灌注损伤不仅导致肠道局部组织坏死、凋亡，还将引发全身炎性反应失控，对其他器官组织产生广泛影响，严重者会导致多器官功能障碍综合征［1，2］。褪黑素是目前发现最强的体内抗氧化成分，在心、脑、肾等器官缺血/再灌注损伤中有明显保护作用［3］。本文拟建立大鼠肠缺血/再灌注模型，观察褪黑素对肠缺血/再灌注损伤的影响。
1 材料与方法
1．1 实验动物与分组
雄性SD大鼠60只(兰州医学院实验动物中心提供)，体重200 g~250 g，随机分为5组：假手术组10只，仅分离肠系膜上动脉；缺血/再灌注组10只，分离并钳夹肠系膜上动脉，腹腔注射生理盐水；缺血/再灌注+注射溶媒组10只，分离并钳夹肠系膜上动脉，腹腔注射2％无水乙醇，生理盐水；褪黑素不同剂量组，各15只。褪黑素(购自瑞士ALEXIS公司)先以无水乙醇将褪黑素溶解，再加生理盐水稀释，使乙醇浓度<2％，然后按褪黑素10 mg/kg、20 mg/kg等容分别腹腔注射。
1．2 肠缺血/再灌注模型的制作
动物禁食18 h，不禁水。手术室温度维持在27 ℃~28 ℃，称重，麻醉采用戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射。腹部正中脱毛，消毒铺巾，正中切口进腹，分离肠系膜上动脉，以无创血管夹夹闭肠系膜上动脉根部，30 min后松开血管夹，进行再灌注。在再灌注前5 min，组腹腔注射溶剂，组腹腔注射褪黑素，再灌注30 min后进行第二次腹腔注射。再灌注60 min后立即切取距回盲瓣5 cm的小肠，分别墨4％多聚甲醛固定在水浴下制备1∶10肠匀浆，备测，并经心脏穿刺取血，置-20 ℃冷冻保存。
1．3 观察指标
1．3．1 组织匀浆制备及检测
在冰浴下将切取的小肠纵行剖开，在冰0.01 mol/L PBS中漂洗，滤纸吸干，准确称取1 g小肠组织，制成10%组织匀浆，低温离心，取上清液，进行内二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)、过滤氧化氢酶(CAT)测定。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1．3．2 小肠组织切片行HE染色，光镜下观察组织损伤程度
采用Chiu氏6级评分法判断损伤程度：0分为正常黏膜绒毛，1分为绒毛顶端上皮下间隙增大，2分为上皮层与固有层中度分离，3分为绒毛两侧亦有大量分离伴部分绒毛顶端破损，4分为绒毛破损伴固有层毛细血管暴露，5分为固有层破坏、出血、溃疡。
1．3．3 血D乳酸及内毒素测定
血浆D乳酸根据Brandt用SPSS10.0统计学软件包进行单因素方差分析及组间比较，并进行指标间Pearson相关分析。
2 结果
2．1 模型建立情况
各组行肠缺血/再灌注模型制作时，夹闭肠系膜上动脉后肠系膜血管搏动消失且肠壁变苍白。开放血管后血管搏动恢复，肠壁出现充血。再灌注60 min后肠壁充血水肿明显。
2.2 各组实验指标数间比较
与缺血/再灌注组相比，注射褪黑素组病理评分及组织中MDA、NO、iNOS均明显降低，差异有显著性(P<0．05)。随着褪黑素浓度增高，病理评分与MDA、NO、iNOS测量值有下降趋势，其中组与组间MDA水平无统计学意义。与假手术组相比，血浆中D乳酸及内毒素各组均明显升高，而褪黑素组D乳酸、内毒素与溶媒组比较呈下降趋势，并有统计学意义(P<0．05)。见表1，表2。表1 实验指标的各组间均数比较（略）表2 实验指标的各组间均数比较（略）
2．3 各实验指标之间相关性分析 病理学评分与血清D乳酸、NO、iNOS水平呈正相关，而与CAT水平呈负相关。
3 讨论
肠缺血/再灌注损伤不仅见于肠梗阻、肠系膜动脉栓塞等急腹症，更是严重创伤、烧伤后休克复苏中出现的病理过程，导致肠上皮细胞死亡，肠黏膜膜屏障破坏，肠通透性增加，使内毒素吸收增加及细菌易位，引发或加重全身炎性反应［1，2］。缺血/再灌注时超氧阴离子(O2)、NO生成增加和过氧亚硝基阴离子(ONOO)浓度增高是造成再灌注损伤的重要原因。再灌注时富含黄嘌呤氧化酶的肠上皮细胞将产生大量氧自由基，导致细胞膜破坏，引发一系列级联反应；实验表明过量的NO可造成肠黏膜通透性的增加，其机制是NO与O2结合，形成ONOO上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页
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