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Doxycycline抑制人肝癌细胞系HepG2生长的实验研究 |
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保藏中心细胞库，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱内常规培养，每日倒置显微镜观察细胞生长情况，3d换液，适时0.25%胰酶消化传代。四甲基偶氮唑盐（MTT）、DMSO和Doxycycline均购自Sigma公司，TUNEL凋亡检测试剂盒购自Roche公司，FasL兔多克隆抗体及MMP-2鼠单克隆抗体购自SANTCRUZ公司，Fas鼠单克隆抗体购自北京中山公司。
1.2 方法
1.2.1 MTT法检测肿瘤细胞生长能力 取对数生长期HepG2细胞，配成1.5×105 mL-1的单细胞悬液，96孔培养板每孔加入200 μL细胞悬液约3×104细胞，细胞常规培养4 h，贴壁后每孔重新加入含不同浓度Doxycycline的培养液2 μL，使其终质量浓度约分别为5、10、20、30和50 mg/L，每个药物浓度设5个孔。同时设无药对照组5孔，无细胞培养液1孔（调零孔）。37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱内常规培养24、48和72 h，分别取培养板MTT法计算药物作用后的吸光度（optical density,OD）。按以下公式计算细胞生长抑制率：
1.2.2 TUNEL检测细胞凋亡 取对数生长期生长良好的HepG2细胞，将其分别接种于200 mL培养瓶中，细胞贴壁后更换成含终质量浓度分别为5mg/L和20 mg/L Doxycycline的条件培养液作用24、48和72 h。胰酶消化各组细胞后，取1滴细胞悬液于已消毒载玻片上，细胞贴壁生长4 h制成细胞爬片，用1∶1甲醇丙酮固定30 min,保存备用。按TUNEL试剂说明书（Roche）操作，采用倒置荧光显微镜成像，随机选取5个视野300个细胞计算细胞凋亡率。
1.2.3 细胞免疫组织化学法检测FasL、Fas及MMP-2蛋白的表达 应用前述方法制作细胞爬片，分别加入FasL、Fas及MMP-2一抗，用SABC法进行细胞免疫组织化学染色，DAB显色。
1.3 判断标准 FasL、Fas及MMP-2蛋白定位于细胞膜和（或）细胞质，阳性反应为细胞膜和（或）细胞质内着棕黄色颗粒。免疫组织化学结果判定参照文献［4］，以阳性细胞百分比及着色强度计分做半定量分析。随机观察5个高倍视野，根据阳性细胞数占细胞总数的百分比计为0～4分：无阳性细胞为0分，<25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，>75％为4分；染色的深度以多数细胞的显色反应为准，着色强度计0～4分：无色为0分，淡黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分，棕褐色为4分。将上述两项指标的评分相加。每张片分别由2个观察者进行盲法测定，最后取两观察者所得平均值。
1.4 统计学处理 使用SPSS11.0统计软件，多组数据间的比较采用单因素方差分析或独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Doxycycline对HepG2细胞生长的抑制作用 不同浓度Doxycycline作用于HepG2细胞24、48和72 h后，各组OD值见表1，其中24 h各实验组OD值与对照组相比差异无统计学意义（F=1.15,μ>0.05），48h和72 h组较对照组均出现了不同程度的生长抑制作用（F=102.9,F=176.7;P<0. 01），并呈明显的时间和浓度依赖性（图1）。
2.2 Doxycycline对HepG2细胞凋亡的影响 本研究选用5、20 mg/L两个药物浓度观察其对HepG2细胞凋亡的影响,在24 h后各组凋亡率差异无统计学意义（P>0.05），而在作用48、72 h后各实验组细胞凋亡率较对照组明显增加，P<0.01（表2，图2）。
2.3 Doxycycline对HepG2细胞FasL、Fas及MMP-2蛋白表达的影响 本研究选用20 mg/L Doxycycline作用HepG2细胞观察对FasL、Fas及MMP-2三种蛋白表达的影响，作用48 h后，FasL、Fas及MMP-上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页
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