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关于体外肝代谢系统的研究与应用 |
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一步转化为Ⅱ，后者不再被代谢。
1.2.4考察手性药物的代谢立体选择性
周权等［9］把手性药物与大鼠肝微粒体相结合，对其立体选择性代谢作了详细的考察。作者把R/S普罗帕酮（propafenone，PPF）加入经地塞米松或β萘黄酮诱导的大鼠肝微粒体中孵育，经提取及手性拆分后，进入HPLC系统分析。结果显示，与对照组相比，在经诱导的肝微粒体中，PPF的Ⅰ相代谢呈显著的立体选择性。
总之，改进后的体外肝微粒体法耗时少，重现性好，易大量操作。适用于酶活性及体外代谢清除等方面的研究，在实际工作中应用较广。但同其他体外肝代谢方法相比，需要的原材料较多，且与体内情况的一致性方面存在不足，因而其结果是否有利预测体内情况仍需进一步研究。
2基因重组人肝微粒体CYP450酶系
利用基因工程及细胞工程，将调控CYP450酶系表达的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞，再经培养可表达高水平的CYP450酶系，纯化后还可获得较单一的CYP450同工酶。在明确某些药物经特定酶代谢后，即以此酶进行单一代谢，更准确地观察代谢结果，避免受其他酶共同参与此代谢途径的干扰。Ching等［10］通过在酵母中克隆方法，得到高表达的人CYP 1A1和CYP 1A2，用于测定普萘洛尔对映体的去烃基化和环羟化反应的立体选择性和酶动力学参数，明确了CYP 1A2均参与了2种途径，但CYP 1A1只参与了去烃化反应。有学者进一步运用重组人肝微粒体，应用酶抑制剂对普萘洛尔对映体的代谢途径进行对照实验［11-13］。其中Yoshimoto等［12］ 应用基因重组的及人肝微粒体中的CYP酶系同工酶进行研究，发现α萘黄酮对普萘洛尔R/S对映体的N脱异丙基化（desisopropylation）抑制作用分别为20%和40%；奎尼丁对其2种对映体的4环羟化代谢的抑制作用较完全；而其他酶抑制剂对其对映体的影响较小。
基因重组CYP450酶系与前述的肝微粒体在研究药物代谢方面具有一定的相关性。但前者在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法，并可在分子水平上，为药物与酶在结合位点
的相互作用研究提供更多的信息。尽管该方法先进性较为突出，但由于受到设备条件和技术的限制，通过基因工程获得的酶量与种类仍较有限，纯化程度有待进一步提高，故其作为研究代谢的体外系统的地位仍有待进一步提高。
3肝细胞培养
3.1体外培养技术与细胞活性的维持
体外培养包括肝细胞株的培养和原代肝细胞的分离与培养。根据细胞来源于不同，经重复筛选可制备出不同型号的肝细胞株，满足各种实验需要。肝细胞株容易贴壁存活，在相对稳定的培养条件下，传20～30代不会出现明显衰老现象。原代细胞需经过从器官中分离的过程，存在分离难度大、体外培养要求条件高、存活时间短、增殖及传代困难等问题。多数研究者采用改良的Seglen两步胶原酶灌注法。但此法操作繁琐，设备及实验技术要求高，影响因素较多［14］，包括灌注液的种类和速度、肝脏灌洗是否充分、分离消化的酶、培养液的组成和肝细胞悬液的离心清洗等。鉴于上述原因，刘友平［15］等采用肝组织块贴壁法原代培养，即只把组织块剪碎，不用胶原酶消化，直接按肝细胞的培养方法进行贴壁培养，在传代时加胰酶消化，只取上层细胞悬液继续培养。该法简单快捷，无需灌注、离心，所得肝细胞活力高。
为了解决肝细胞活性体外维持时间短的问题， Hengstler［16］等研究优化肝细胞冷冻技术。同新鲜肝细胞相比，经过该技术冷冻储藏的肝细胞活性为新鲜肝细胞的80%以上，而其Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶的活性>60%，可用于反应时间不超过8h的代谢研究，亦可用于药酶的诱导研究，但该技术仍需进一步优化。
3.2肝细胞培养的主要应用
3.2.1进行药物体外代谢途径与体内相关性研究
Nakagawa等［17］ 将BPA［2,2bis(4hydroxyphenyl)propane，2,2双(4羟苯基)丙烷］加于大鼠肝细胞中，经质谱检测，BPA很快代谢为单葡萄糖醛酸结合物及2个次要代谢物（单硫酸结合物和3OHBPA）。在BPA体内代谢研究中发现，约20%～30%的BPA从尿中排泄，主要为首过效应中生成的葡萄糖醛酸结合物上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页
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